【兽医肿瘤前沿】体外蛋白酶体抑制剂对犬淋巴瘤细胞对CHOP化疗反 ...

胡璠

体外蛋白酶体抑制剂对犬淋巴瘤细胞对CHOP化疗反应的影响

翻译：徐晋

摘要 

犬淋巴瘤的标准治疗是CHOP化疗方案。蛋白酶体抑制剂已与CHOP一起用于人类血液系统恶性肿瘤的治疗，但在犬淋巴瘤中的应用仍有待充分探索。在15例淋巴瘤患犬中，我们发现了蛋白酶体亚基mRNA高表达与CHOP化疗反应差之间的关系，并试图确定蛋白酶体抑制剂对犬B细胞淋巴瘤细胞系(CLBL-1)活力的影响。本研究的目的是研究蛋白酶体抑制剂是否使这些细胞对CHOP药物多柔比星、长春新碱和环磷酰胺(4-羟基环磷酰胺/4-HC)增敏。CLBL-1细胞对硼替佐米和伊沙佐米的蛋白酶体抑制作用敏感。硼替佐米的IC 50为15.1 nM，伊沙佐米的IC 50为59.14 nM。蛋白酶体抑制剂联合多柔比星对CLBL-1细胞活力有协同作用;蛋白酶体抑制剂+长春新碱的作用随组合比例的不同而不同，与4-HC存在拮抗作用。这些结果可能具有临床实用性，因为蛋白酶抑制可能与增效CHOP化合物一起使用，以改善淋巴瘤患犬对化疗的反应性。

 

关键词：硼替佐米，环磷酰胺，犬，多柔比星，伊沙佐米，长春新碱

 

1 简介

淋巴瘤是犬中最常见的自发性癌症之一，占犬肿瘤诊断的6%-12%。B细胞淋巴瘤是犬中最常见的免疫表型，占犬淋巴瘤诊断的63%-80%。在犬B细胞淋巴瘤中，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的类型，约占所有淋巴瘤的50%。

鉴于犬淋巴瘤是一种全身性疾病，化疗是首选的治疗方式。如果不接受治疗，被诊断为高级别淋巴瘤的犬的中位生存期通常不到6周。通过目前的标准CHOP化疗干预，中位生存期延长至10 -14个月。CHOP是一种多药化疗方案，由四种细胞毒性药物组成：环磷酰胺、羟基柔红霉素(多柔比星)、长春新碱(Oncovin)和泼尼松。犬DLBCL对CHOP治疗有反应，总体反应率超过80%。尽管如此，淋巴瘤患犬平均在一年内就会死于这种疾病，而且通常在达到临床缓解后6个月疾病就会发展。

蛋白酶体活性在与癌症相关的重要细胞功能中发挥作用，例如通过降解细胞周期调节蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶促进细胞周期进展。NF-κb信号通路是淋巴瘤生长和增殖所依赖的另一种细胞周期调节机制，它受蛋白酶体的调节。通过IκB与NF-κB的结合，抑制NF-κB的活化，掩蔽核内定位信号，阻止其转位到细胞核内。通过降解IκB，蛋白酶体使NF-κB转位至细胞核，并激活其下游靶点的转录。蛋白酶体活性还有助于清除受损的细胞内蛋白，从而减轻蛋白毒性应激，提供针对凋亡途径的保护。在各种人类癌症类型中，已检测到26S蛋白酶体水平升高和蛋白酶体活性增加。在犬癌症的背景下，研究表明，与没有癌症的犬相比，各种恶性癌症类型患犬的血清26S蛋白酶体浓度显著增加。蛋白酶体在癌基因形成中的作用以及在犬肿瘤中的增加使蛋白酶体活性成为潜在的治疗靶点。

 蛋白酶体抑制已被证明在多种癌症类型中诱导凋亡，而且癌细胞似乎比正常细胞对蛋白酶体抑制更敏感。目前，有3种蛋白酶体抑制剂被FDA批准用于治疗人类癌症：硼替佐米、伊沙佐米和卡非佐米。在人类DLBCL患者中，硼替佐米与R-CHOP联合治疗活化B细胞(ABC)和分子高分级(MHG)亚型比单独使用R-CHOP更有效，具有更高的应答率和更长的生存时间。ABC亚型与NF-κB通路的组成性激活相关。在靶向NF-κB转录调控的背景下，蛋白酶体抑制可以稳定IκB与NF-κB的结合，从而阻止NF-κB的激活。MHG亚组与NF-κb激活无关，而应答改善被推测与蛋白酶体减弱MYC-驱动的蛋白毒性应激(导致细胞死亡)效应的能力受到抑制相关。MYC在犬弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤中常呈高表达。硼替佐米联合R-CHOP治疗人DLBCL17的成功表明，蛋白酶体抑制剂与CHOP药物在犬淋巴瘤中有协同作用的潜力。

鉴于犬DLBCL的高患病率和CHOP治疗后较差的总生存时间，有必要在这一背景下进行治疗提升。之前的研究探索了蛋白酶体抑制剂硼替佐米对犬细胞系CLBL-1以及T细胞淋巴瘤和黑色素瘤犬细胞系的影响，发现硼替佐米抑制这些细胞的生长；然而，关于蛋白酶体抑制联合CHOP药物的疗效知之甚少。因此，我们试图研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米和伊沙佐米单独或联合CHOP试剂48小时对犬DLBCL细胞株CLBL-1活力的体外影响。

 

2 研究方法

2.1 生存分析和RNA-Seq

25例犬淋巴瘤病例的RNA-Seq数据在开始CHOP治疗方案之前获得。由于队列规模小和免疫分型不完整，我们使用队列中最一致的转录谱来减小数据集中的噪声。从25例病患中，我们选择了15例，他们的表达谱在层次上聚集在一起，并排除了T细胞病患(图S1;表S1)。为了确定哪些基因的表达是无进展生存(PFS)的首要预测因素，我们对基因表达FPKM值和临床PFS数据进行了弹性网状logistic回归分析。蛋白酶体亚基PSMB1是最主要的预测因子。将病患分为PSMB1高表达组(PSMB1表达中位数及以上)和PSMB1低表达组(PSMB1表达中位数以下)。采用log-rank Kaplan-Meier法比较PSMB1高表达组和低表达组病患的PFS。从HGNC检索到的45个蛋白酶体基因列表中，37个在CanFam 3.1基因组和基因表达数据中与犬同源。然后计算37个蛋白酶体亚基基因的Wilcoxon检验p值和log2倍变化，比较PSMB1高表达组和低表达组的FPKM值。此外，对PSMB1高表达组和低表达组进行DESeq2全基因组差异表达分析。本文的RNA测序结果已保存在NCBI的基因表达综合数据库中，可通过GEO系列登录号GSE130874访问。

 

2.2 细胞系验证

本研究中使用的细胞系是一种特征明确的犬B细胞淋巴瘤细胞系(CLBL-1)，来源于一只IV期弥漫性大细胞淋巴瘤犬的细针抽吸物。CLBL-1细胞直接从原始细胞获得，无需进一步验证即可使用。

 

2.3 细胞存活试验   

CLBL-1细胞用100μL含10%胎牛血清及相应浓度化合物的RPMI 1640培养基孵育48 h。当测定中蛋白酶体抑制剂存在时，二甲基亚砜(DMSO) (Fisher Scientific)以与蛋白酶体抑制剂的最高剂量相等的浓度作为溶剂对照。细胞以密度为1×104/孔铺于96孔板，并立即给予一系列剂量的硼替佐米(Selleckchem)、伊沙佐米(Selleckchem)、4-HC (Toronto Research Chemicals)、盐酸多柔比星(Sigma)或硫酸长春新碱(Sigma)处理。处理24 h后，加入阿尔玛蓝 (Thermo Fisher)，再处理24 h后，使用Biotek Synergy2平板识读器测定570和600 nm波长下的吸光度。使用以下公式计算活细胞的相对百分比：

 

将硼替佐米或伊沙佐米以0.001-10μM的剂量加入CLBL-1细胞中。加入4-HC、盐酸多柔比星和硫酸长春新碱的剂量范围分别为0.00625-100μM、0.00183-1.83μM和0.00121-121 nM。每一实验使用8孔/剂量并且至少重复3次并且计算每一剂量的平均值和标准误。4-HC显示出跨孔细胞毒性的迹象，之前被归因于其挥发性。因此，包含4-HC的所有检测均使用每96孔板一次剂量进行：也就是说，每个浓度使用8孔/板，每个浓度使用一个单独的板。

 

2.4 培养条件

将CLBL-1悬浮细胞置于含碳酸氢钠、不含l -谷氨酰胺(Sigma)、含1% 10 000 U/mL青霉素/10 000μg/mL链霉素(Hyclone)和10%胎牛血清(FBS) (Gibco)的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2的湿化大气中培养。细胞在解冻后20代内使用。

 

2.5 药物联合试验

探讨蛋白酶体抑制联合CHOP方案对CLBL-1细胞活力的影响。CLBL-1细胞单独用培养基(阳性对照)、单独用单药或不同剂量的两种药物联合孵育48 h。当硼替佐米或伊沙佐米与4- HC、盐酸多柔比星或硫酸长春新碱联合时，这些药物以一定的剂量以恒定的方式联合，以维持IC 50: IC 50比值或临床上可达到的峰值血浆浓度C max:C max比值(表1)。报告了治疗剂量治疗后犬血浆中每种CHOP药物的C max浓度。由于蛋白酶体抑制剂在兽医学中是相对较新的药物，因此没有关于犬的C max的药代动力学数据，我们使用了已报道的人的血浆峰值水平。

剂量范围包括每种药物对应的IC 50浓度的0.25、0.5、1、2和4倍，或者，从C max开始，我们进行4倍连续稀释，直到药物浓度低于相应药物的IC 50(每种药物在此范围内的最少5种剂量)。这确保了整个效应范围都包含在使用的剂量范围内。我们使用恒定的IC 50或C max比值，以确保可以构建药物组合的剂量-效应曲线。每种药物组合试验至少重复3次，每个剂量和组合剂量以8个样本表示。每种药物单独或联合用药对CLBL-1细胞活力的影响以图形形式表示为受累(Fa)细胞的比例随剂量的函数，后者以IC 50或C max的比例表示。

 

2.6 统计分析

使用Prism 9.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA)进行4个参数变斜率非线性回归分析，计算各药物对细胞活力的等效50%抑制浓度(IC 50)，拟合S形量效曲线。采用Prism 9.0绘制各药物及联合用药的量效关系图。

对于联合用药分析，使用CompuSyn (CompuSyn Inc.)计算与每种联合用药相关的联合指数，以推断药物相互作用的性质。每种药物单独用药和联合用药的相应量效关系数据经过标准化处理，以减去无细胞对照中阿尔玛蓝的基线降幅。利用Chou和Talaylay提出的组合指数确定协同作用的基础由下式表示：

联合指数(CI)＝(D)1 /(Dx)1+(D)2 /(Dx)2

其中(Dx)1和(Dx)2表示每种药物单独对细胞活力产生x%影响的浓度，而(D)1和(D)2是产生相同效果的药物联合浓度。当CI＜1时存在协同效应，当CI＞1时存在拮抗效应，当CI =1时存在相加效应。

 

3 结果

3.1 蛋白酶体亚单位表达是淋巴瘤犬PFS的预后因素

对15例接受CHOP化疗的淋巴瘤患犬的RNA-Seq数据进行弹性净logistic回归分析，发现PSMB1是PFS的预后因素。比较PSMB1高表达组和低表达组的PFS，产生了显著的时序p值为.033(图1A)。比较PSMB1高表达组和低表达组的37个蛋白酶体亚单位的FPKM基因表达，7个有显著的错误发现率(FDR)校正的p值<.05，包括PSMB1, PSMB3, PSMB7, PSMC1, PSMC2, PSMD2和PSMD12(图1B,C)。DESeq2全基因组差异表达比较高和低PSMB1表达组，导致29个基因具有FDR校正的p值<.05，包括ETV4、ETV5、CCR4和CXCR3(图S2;表S2)。

 

3.2 蛋白酶体抑制剂或CHOP化疗单药可抑制CLBL-1细胞生长

硼替佐米和伊沙佐米以剂量依赖性方式抑制CLBL-1的生长(图S3)。硼替佐米和伊沙佐米的相对IC 50分别为15.1和59.14 nM。与伊沙佐米相比，硼替佐米具有更强的抑制细胞生长的作用，表现为较低的 IC 50。

4-HC、盐酸多柔比星和硫酸长春新碱均以剂量依赖性方式抑制CLBL-1的生长(图S4)。4-HC、多柔比星和长春新碱的相对IC 50分别为12.19μM、111.5 nM和156.1 pM。长春新碱需要最低的剂量能产生其最大的效果，因此它似乎具有最高的效力，而4-HC是所测试的CHOP化疗药物中效力最低的。

 

3.3 硼替佐米联合4-HC对CLBL-1细胞的生长具有拮抗作用

硼替佐米和4-HC单药抑制CLBL-1细胞生长(图2A,B)，但两药联合对细胞生长产生了高效应水平的拮抗作用(图2C)。这表明，需要更多的药物才能达到单独使用任何一种药物所能达到的相同的效果，这种药物组合似乎是由4-HC对细胞生长的影响所驱动的。联合用药的剂量- Fa曲线与4-HC单药时相似。对于以IC 50∶IC 50比值(图2A)和C max∶C max比值(图2B)的这些药物的恒定组合，情况也是如此。用comsyn软件联合分析显示，当硼替佐米和4-HC以cmax: cmax比例联合使用时，在低Fa水平下具有协同作用(CI > 1)，而当以IC 50 :IC 50比例联合使用时，在相似Fa水平下具有拮抗作用(图2C)。此外，组合分析显示，联合剂量的CI大于1，产生较高的Fa的IC 50:IC 50和C max:C max比值，表明拮抗反应。

 

3.4 硼替佐米联合多柔比星对CLBL-1细胞生长具有协同作用

在本研究给出的剂量范围内，硼替佐米和多柔比星单药抑制细胞CLBL-1细胞生长，联合用药产生高效应水平的协同作用(图3)。在来自IC 50的剂量范围内，硼替佐米和多柔比星对细胞生长显示出相似的作用。Fa随剂量变化时，除C max:C max比值中最高的剂量组合为拮抗外，其余两种组合在恒定的组合比例下均以协同作用为主。剂量-Fa曲线表明，对于两种组合比例，联合剂量对细胞生长产生的效应优于每种药物单独产生的效应(图3A,B)，并且在几乎所有测试剂量下均具有协同效应(图3C)。与治疗相关的高Fa水平的CI主要表现为协同作用，特别是在IC 50:IC 50的比率中。

 

3.5 硼替佐米联合硫酸长春新碱对CLBL-1细胞的生长具有协同或相加作用

当以cmax联合时，长春新碱和硼替佐米对细胞生长产生高效应水平的协同作用：在IC 50:IC 50比例的药物组合的Fa -剂量曲线上(图4A)，长春新碱的作用弱于硼替佐米，但与单独使用中等剂量的硼替佐米相比，长春新碱的加入似乎略微增加了对细胞生长的作用。然而，当以C max:C max比率组合时，这种改善更加明显(图4B)。以IC 50:IC 50比值联合长春新碱和硼替佐米导致CI值接近1，表明有轻微的相加效应，但在C max:C max比值中，这种效应是协同的，因为所有测试剂量的CI值都小于1(图4C)。

 

3.6 伊沙佐米联合4-HC对CLBL-1细胞的生长有相加或轻度拮抗作用

伊沙佐米和4-HC单药抑制CLBL-1细胞生长，但两种药物联用在高效水平产生了相加或轻微拮抗作用(图S5)。在较大剂量和两个剂量范围内，4-HC似乎均比伊沙佐米更强效(图S5 A,B)。当Fa作为剂量的函数绘制时，类似于硼替佐米的情况，这种药物组合似乎是由4-HC对细胞生长的影响驱动的。联合用药的剂量-Fa曲线与4-HC单药时相似。对于以IC 50:IC 50(图S5A)和C max:C max比值(图S5B)表示的这些药物的恒定组合，情况也是如此。组合分析表明，对于两个组合比，CI值均接近或大于1(图S5C)。

 

3.7 伊沙佐米联合多柔比星对CLBL-1细胞生长具有协同作用

伊沙佐米和多柔比星联用对细胞生长产生高效应水平的协同效应(图S6)。在来自IC 50和C max的剂量范围内，伊沙佐米和多柔比星显示出相似的效应，但多柔比星似乎略强。当Fa随剂量变化时，除C max:C max比例中最高的剂量组合为拮抗外，在两个恒定的组合比例下，该药物组合对细胞生长的影响大多为协同作用。剂量-Fa曲线表明，对于两种联合比例，合并剂量产生的效应优于每种药物单独产生的效应(图S6A,B)，并且在几乎所有高效应水平的试验剂量下均具有协同效应(图S6C)。与治疗相关的高Fa水平的CI主要表现出协同作用，尤其是在IC 50:IC 50的比值中。

 

3.8 伊沙佐米联合长春新碱对CLBL-1细胞的生长有不同程度的影响

当以C max:C max比值组合时，长春新碱和伊沙佐米对细胞生长产生高效应水平的协同作用，而当以IC 50:IC 50比值组合时，则相反地显示出拮抗作用(图S7)。在IC 50:IC 50联合用药中，长春新碱的效力低于伊沙佐米(图S7A)，但与低中剂量伊沙佐米单独用药相比，加用长春新碱似乎产生了轻微的相加效应。此外，以C max: C max比值表示的低剂量长春新碱似乎对细胞生长的影响强于伊沙佐米，而联合使用低剂量伊沙佐米似乎增强了这一作用(图S7B)。在C max:C max比值中，这一效应具有协同作用，因为对于所有测试剂量，CI值均小于1(图S7C)。

 

4 讨论

我们确定了蛋白酶体亚单位表达在DLBCL犬对CHOP的不同反应显著相关。我们还发现在PSMB1高表达的病患中，ETV4, ETV5和CXCR3表达上调，CCR4表达下调。ETV4和ETV5是转录因子，有证据表明它们调节CXCR基因的转录。CXCR3和CCR4是趋化因子受体，研究发现在人外周T细胞淋巴瘤和ALK阴性的间变性大细胞淋巴瘤中存在以CXCR3和CCR4表达为特征的两种亚型(CXCR3 + CCR4-和CXCR3-CCR4+)，且CXCR3 + CCR4-的淋巴瘤预后较差。虽然我们的数据来自一个小队列，但它为这些亚型的存在提供了一些额外的支持，并提示它们可能存在于犬淋巴瘤中。此外，我们的结果表明，蛋白酶体在CXCR3 + CCR4-病患中表达较高，在CXCR3-CCR4+病患中表达较低，可能与这些病患的不良预后有关。

我们的研究结果表明，蛋白酶体抑制可以有效地抑制CLBL-1细胞的生长。与伊沙佐米相比，硼替佐米对细胞活力的影响似乎最强，这反映在达到50%抑制所需的剂量较低。伊沙佐米是效果较差的蛋白酶体抑制剂，这可能反映出伊沙佐米从蛋白酶体解离的速度比硼替佐米快6倍。本研究中硼替佐米的IC 50为15.1 nM，略高于之前报道的该细胞系的IC 50 (3.95 nM) 19，这可能反映了实验方案的差异，如暴露时间和用于定量效应的检测方法。虽然我们的研究是第一项探索伊沙佐米对犬淋巴瘤细胞活力影响的研究，但之前的研究表明，伊沙佐米在人T细胞淋巴瘤细胞系中的IC 50为41 nM 34，这与本研究中观察到的59.14 nM IC 50相当。

就给药剂量而言，长春新碱似乎是CHOP化疗药物中最有效的，因为它具有CHOP药物中最低的观察到的IC 50 (156.1 pM)。在目前的CHOP方案(0.5-0.7 mg/ m2)中，长春新碱也是治疗犬淋巴瘤的最低剂量的试剂。之前曾报道硫酸长春新碱在CLBL-1细胞中的IC 50约为554 pM 36。两者之间的差异可能是由于技术差异(阿尔玛蓝还原vs. MTT测定)。

CLBL-1细胞对多柔比星体外敏感，其IC 50为111.5 nM，与之前两项使用CLBL-1细胞的研究结果相似。此外，CLBL-1细胞对4-HC(环磷酰胺的代谢活性代谢物)也敏感。另一项对CLBL-1细胞的研究报告了142 nM 的4-HC IC 50，这比在这里获得的12.19μM要有效得多。然而，4-HC具有挥发性，并且已被证明在96孔板中引起跨孔细胞毒性，这一问题在之前的研究中显然未得到解决，这可能导致了报告中认为的4-HC效力增加。在我们的研究中，4-HC联合蛋白酶体抑制在高效应水平(即Fa>0.7)产生轻微的拮抗作用。高Fa水平(即Fa = 0.7-1)的CI与癌症治疗的相关性更大，因为杀死小剂量的癌细胞在癌症治疗中没有用。

当与多柔比星联合用药时，蛋白酶体抑制似乎对CLBL-1细胞的活力有协同作用。然而，对于使用的两种蛋白酶体抑制剂，似乎在C max:C max比值的最高浓度时存在拮抗作用，可能提示细胞内药物相互作用不再在最佳的阈值。硼替佐米和多柔比星之间的协同作用已被证明出现在人类淋巴瘤的临床病例和犬骨肉瘤细胞中。蛋白酶体抑制在人肿瘤细胞中诱导细胞周期阻滞和凋亡发生在G2-M期，而多柔比星可诱导细胞凋亡发生在S期和G0-G1期。因此，多柔比星联合硼替佐米可能通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡在细胞周期的各个阶段对淋巴瘤细胞产生双重作用。体外研究和人类血液肿瘤的基因表达谱表明，硼替佐米还可通过下调DNA修复酶的转录使淋巴瘤细胞对DNA损伤增敏。多柔比星以剂量依赖性方式与26S蛋白酶体相互作用并抑制26S蛋白酶体，并利用蛋白酶体转运至细胞核，提示本研究中观察到的多柔比星和硼替佐米联合用药的协同作用可能与蛋白酶体靶向作用有关。硼替佐米还被证明具有脱靶效应，即抑制线粒体丝氨酸蛋白酶ClpXP和LonP151。这些蛋白酶调节线粒体的稳态，它们的表达与癌细胞的存活相关，而它们的耗竭与癌细胞的生长减弱和死亡增加相关。

当长春新碱与蛋白酶体抑制剂联合应用时，不同的药物组合比例会产生不同的效果。在蛋白酶体抑制对总体细胞活力贡献较小的剂量组合中，长春新碱显示出更大的效果。对这一发现的一种解释是，蛋白酶体抑制与长春新碱有协同作用，但这种协同作用可能取决于这些药物的应用顺序。Goy等的研究结果支持这一观点，他们在人淋巴瘤细胞系中观察到硼替佐米和长春新碱之间的协同作用。然而，如果先用长春新碱再用硼替佐米处理细胞，则协同作用的程度更大。而硼替佐米预处理后再加入长春新碱，则上述协同作用消失。我们的结果提示，当CLBL-1细胞聚集在M期时，硼替佐米或伊沙佐米诱导凋亡的效果最好，但这需要进一步研究来确定。临床上，在人DLBCL治疗中，R-CHOP与不含长春新碱的硼替佐米+ CHOP无差异，硼替佐米联合长春新碱与更严重的不良事件(特别是外周神经病变)相关。需要更多的研究来确定长春新碱和硼替佐米是否适用于犬淋巴瘤的联合用药。

人和犬血浆中长春新碱的 C max分别为101.7和144.25 nM。然而，不同物种之间的4-HC最大浓度有显著差异(人类50为700μM，犬50为69.9μM 25)。这可以归因于犬比人更能有效地将环磷酰胺转化为活性4-HC，这几乎完全归因于对母药的高亲和力。此外，对于多柔比星，人和犬之间的血浆 C max差异约为10倍(分别为10μM vs. 757.96 nM)。患者体内的多柔比星 C max高于给予同等剂量(mg/kg)的犬，而且研究还表明，犬需要更高的给药剂量才能达到相同的药物暴露。此外，对于犬和人，多柔比星药代动力学有高度的个体间和个体内变异性。由于蛋白酶体抑制在犬癌症治疗中是一个相对较新的领域，关于蛋白酶体在患犬中的药代动力学的研究有限。对这些试剂在犬体内动力学的进一步评估将阐明我们研究中使用的浓度之间的关系，以及在这一物种中可达到的治疗水平。本研究中使用的硼替佐米和伊沙佐米C max值在人类复发性多发性骨髓瘤患者的血浆中被报道。

这些结果表明，在现有方案(如CHOP化疗)的基础上加用蛋白酶体抑制剂可能对治疗犬淋巴瘤有益。根据我们的研究结果，我们预测最大的获益来自与多柔比星的联合治疗，除非这种联合治疗引起不可耐受的不良反应。进一步的研究应该致力于探索其他犬淋巴瘤细胞系，原代犬淋巴瘤细胞，体内模型和犬药代动力学研究。

 

 

图1 15例接受CHOP化疗的犬淋巴瘤病例的蛋白酶体亚单位表达的RNA-Seq分析结果。

(A) Kaplan-Meier生存曲线，比较根据中位PSMB1表达值分层的病患的无进展生存期(PFS)。黑线表示PSMB1表达中位数及以上的病患，灰线表示PSMB1表达低于中位数的病患。

(B) 火山图显示错误发现率调整的Wilcoxon检验p值和37个犬蛋白酶体亚单位基因PSMB1表达组之间的Log2倍变化，根据中位PSMB1表达值分层。

(C) 箱形图显示每例病患的每千碱基转录本映射的片段(FPKM)值，将PSMB1表达中位数及以上的病患用黑色表示，将PSMB1表达低于中位数的病患用灰色表示。Wilcoxon检验p值显示了每次比较。

 

 

图2硼替佐米、4-HC或两者联合治疗48小时后，受累CLBL-1细胞的比例与剂量的关系，以及相应的联合指标硼替佐米和4-HC以IC 50:IC 50 (A)或C max:C max (B)的比例进行组合。组合分析显示为两种药物组合比例(C)的组合指数(CI)作为受累细胞比例(Fa)的函数。值表示为N重复的平均值，并显示相应的标准误。

 

图3硼替佐米、阿霉素或两者联合治疗48小时后，受累CLBL-1细胞的比例与剂量的关系以及相应的联合指标硼替佐米和多柔比星以IC 50:IC 50 (A)或C max:C max (B)的比例进行组合。组合分析显示为两种药物组合比例(C)的组合指数(CI)，其作为受累细胞(Fa)的函数。值表示为N重复的平均值，并显示相应的标准误。

 

 

图4硼替佐米、长春新碱或两者联合治疗48 h后，受累CLBL-1细胞的比例与剂量的关系以及相应的联合指数。硼替佐米和长春新碱以IC 50:IC 50 (A)或C max:C max (B)的比例进行组合。组合分析显示为两种药物组合比例(C)的组合指数(CI)，其作为受累细胞(Fa)的函数。值表示为N次重复的平均值，并显示相应的标准误。

 

药物	IC 50	C max
硼替佐米	15.1 nM	501 nM
伊沙佐米	59.14 nM	300 nM
4-HC	12.19 μM	69.9 μM
盐酸多柔比星	111.5 nM	757.96 nM
硫酸长春新碱	156.1 pM	144.25 nM

表1蛋白酶体抑制剂和CHOP成分的IC 50和C max。

注：在CLBL-1细胞系中，不同剂量的每种药物处理48 h后，通过细胞活力分析测定IC 50值。C max数据是基于在人或犬血浆中每种药物治疗后发表的值。

南海

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杨先生