犬单核细胞性埃里希体病的诊断

刘欣

作者Shimon Harrus a,*, Trevor Waner，翻译刘如静，校对刘欣
由立克次体属的犬埃里希体病原引起的犬单核细胞性埃里希体病（CME）是一种遍布全世界的犬的重要疾病。由于它不同的病程阶段和多样的临床症状，使得疾病的诊断受到了挑战。当出现相关病史（在疾病流行地区生活或到此旅游过，即曾与蜱虫接触）、典型的临床症状、血液学特征，以及生化指标异常时应怀疑CME。传统的诊断技术是诊断CME的有效工具，包括血液学、细胞学、血清学和分离，但是犬感染埃里希体病原的确切诊断要求分子学的技术。本文综合了目前文献资料记载的犬感染埃里希体病原的诊断方法。
关键词
Ehrlichia canis  犬属埃里希体病原
Canine monocytotropic ehrlichiosis 犬单核细胞性的埃里希体病
Diagnosis  诊断技术
Serology  血清学
PCR  聚合酶链式反应
简介
由立克次体属的犬埃里希体病原引起的犬单核细胞性埃里希体病（CME）是一种遍布全世界的犬的重要疾病。在1935年，阿尔及利亚，Donatien 和Lestoquard 发现了本病。在19世纪80年代后期，越南战争时，以德国牧羊犬为主的美国军犬大量死于本病，使得疾病被广泛关注。CME的病原代表是一种由蜱虫（血红扇头蜱）传播的在细胞内存在的立克次氏体，犬属埃里希体病原微生物。
犬属埃里希体病原是一种革兰氏阴性、有多种形态的微生物，包裹着一层薄膜。单个环形的染色体由1315030个核苷酸组成。病原的感染主要发生在温暖的季节，也就是传播媒介蜱虫活跃的时期。大多数处于急性期或者亚临床期的病犬，在合适的时间，可通过适宜剂量的强力霉素或者四环素来治疗。一些进入了疾病慢性阶段的犬，会预后不良。
由于它不同的病程阶段和多样的临床症状，使疾病诊断受到了挑战。当出现相关病史（在疾病流行地区生活或到此旅游过，即曾与蜱虫接触）、典型的临床症状、血液学特征，以及生化指标异常时，应怀疑CME。传统的诊断技术是诊断CME的有效工具，包括血液学、细胞学、血清学和分离，但是犬感染埃里希体病原的确切诊断要求分子学的技术。本文综合了目前文献资料记载的犬感染埃里希体病原的诊断方法。
临床症状
在急性期、亚临床期或慢性期，CME是一种多系统表现的疾病。E. canis 可以感染各品种的犬，但德国牧羊犬更易被感染，疾病过程更严重，并伴随比其他品种犬更高的发病率和死亡率。已经证实本病没有年龄或者性别偏好的特点。由不同种类的E. Canis感染，与其他节肢动物传播的病原，例如与同一传播媒介传播的犬优氏巴贝西虫和犬肝簇虫混合感染时，也许会引起不同的发病症状。
本病的急性期特征为高热、沉郁、嗜睡、厌食、淤斑、鼻血、淋巴结肿大、脾肿大和出血性倾向。后期常表现出皮肤出血点、瘀斑和鼻出血。眼科的病变频发，包括前葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎、视神经乳头水肿、视网膜出血、存在视网膜外周浸润和大疱性视网膜脱离。血液粘稠度过高引发的视网膜下的出血和视网膜脱离也许会导致失明。神经方面的表现大多是脑膜炎或者脑膜出血。
在疾病的亚临床阶段并没有明显的临床症状。一些犬会发展成CME的慢性阶段，原因并不清楚。在疾病的慢性期，症状和急性期发生的相似，但会更严重。
在这个阶段，黏膜苍白、体弱、出血和明显的体重减少是常见症状。
血液学特征
全血细胞计数（CBC)是诊断CME的必要手段。在急性期，中度或严重的血小板减少是血液学特有的表现。血涂片是评估血小板数量的必要方法，为了证明真正的血小板减少而不是体外的假性血小板减少。已感染的实验犬，在约感染后10天，有明显的血小板减少，在感染后第三周，血小板数量降到最低，血小板的数量变化范围从20000/IL到52000/IL。从感染后6天开始平均血小板体积（MPV）有以逆向模式增长。在急性期的血小板减少，通常伴随着轻微的贫血和轻度的白细胞数减少。
在亚临床阶段，有轻微的血小板减少，缺乏临床症状。在实验中，已感染的犬，血小板数量减少到42%，经检测，数量已低至140000/IL。白细胞和红细胞数量也许也会减少，但是这些变化是轻微的，在临床环境中很难注意到。在慢性阶段，通常出现严重的血小板减少症，并伴随显著的贫血和白细胞减少。由于骨髓发育不良造成的显著的全血细胞减少，是慢性阶段重症的特点。
在疾病流行地区，血小板的数量和形态已被建议用作筛检CME的方法。通过聚合酶链式反应（PCR）检测，对E. CanisS DNA(16S rRNA)显阳性的，在71只非血小板减少（血小板数量>200000/IL)的犬中，只有一只（1.4%），，血小板数量在100,000–200,000/lL范围内的犬为13/62只（21%），血小板数量<100,000/lL 的84只犬中，有53只（63.1%）对 E. Canis显阳性。这强调出，正确的血小板计数评价对疑似的病犬有重要意义。
血清学评价
光学显微镜下，在血涂片中，单核细胞细胞质中出现的典型E. Canis桑椹体是对于CME强有力的诊断。在电子显微镜下，桑葚体是有着薄膜包裹的液泡，通常充满了密集的细胞。不幸的是，桑椹体的监测是困难的，并且耗时长，预计只有4%的案例是成功的。白细胞层多层涂片检测也许是最佳的方法，这显著增加了检测E. Canis桑葚体的机会。在放大1000倍的油镜视野下，白细胞层涂片敏感性已经达到了66%。1000倍油镜下，骨髓的敏感性是34%。1000倍油镜全面扫查需要50到60分钟的时间。
血小板、淋巴细胞嗜苯胺蓝颗粒和吞噬的细胞核物质，均可与埃里希体包涵体混淆。另外，有些属于无形体科的埃里希体病原（查菲埃里希体属、新立克次体和反刍动物埃里希体），或许也能感染犬的单核细胞。根据埃里希体病原分布和特定地域传播媒介的流行病学，在特殊地区应该提示相应的鉴别诊断。这种微生物的PCR分子学特征和测序应该被详细说明。   
感染犬的血涂片也包含着反应性单核细胞、噬红细胞、噬血血小板、 噬核物质现象和大型血小板（图1）。但是，在大多数病例中，红细胞形态,没有明显的变化。在后期，也许会出现颗粒状大淋巴细胞增多症。先前的资料记载，淋巴细胞增多可到13.0×103/ lL(参考范围: 1.5–5.0×103/lL)。在瑞氏染色血涂片中，200个淋巴细胞中约有50%含有明显的嗜苯胺蓝颗粒，细胞核经常裂解，或者成熟细胞核染色质呈锯齿状，它与颗粒共存于淋巴细胞中。临床医生应该能识别这种现象，有些病例也许会被错误的诊断为淋巴白血病。

血涂片检测也是判断与其他蜱虫传播的病原（例如犬巴贝斯虫和犬肝簇虫）混合感染的必要方法，混合感染影响着疾病的表现，严重程度和治疗结果。
生化
CME的血生化变化通常表现为低血蛋白血症、高球蛋白血症和高丙种球蛋白血症。将血清蛋白电泳，多数病例也许会出现多克隆高丙种球蛋白血症，但也会有单克隆高丙种球蛋白血症的发生。处在急性期的病犬还经常伴有丙氨酸氨基转移酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）的少量增加。
CME的临床症状中，也许会出现急性期蛋白浓度增加。在5只被E. Canis感染的犬中，感染后4~16天血浆C-反应蛋白（CRP）浓度增加，15到42天浓度到达最高。另一项研究中，5只接种E. Canis的实验犬，出现了轻微病症，血浆中的CRP和a1-酸性糖蛋白（AAG）水平被检测，12只自然感染的犬有严重临床症状，10只犬对照。在所有被感染E. Canis的实验犬中，感染后4到6天，CRP和AAG的浓度增长了2-9倍。尽管实验犬一直感染E. Canis，在感染后34天，CRP和AAG浓度通常会下降到感染前的水平。多数自然感染的犬会出现严重的临床症状，以及CRP 和AAG水平的增加。
血清学
(2)现已出现几种血清学方法可用于CME的诊断，并被看作检测和诊断的有效工具。感染E. Canis后，检测E. Canis抗原IgG抗体的间接免疫荧光抗体（IFA）试验被认作血清学的金标准。IgM检测并不可靠，因为在疾病过程中，IgM抗体的发展是变化无常的。相反地，推荐间隔7-14天的两次连续IFA 试验，抗体浓度增高了4倍，提示着感染阳性。在立克次体治疗和消除后，抗埃里希体的IgG抗体也会存在几个月或几年。
除了IFA 试验，酶联免疫吸附试验（ELISA）也是一种诊断该疾病的有效方法。检测E. Canis的IgG抗体的斑点ELISA试剂盒，市场上可买到，通常被用作即时检验方法。与 IFA试验相比，有三种不同的斑点ELISA试剂盒可检测此抗体：(1) 基于主要重组抗原蛋白2(rMAP2) 的ELISA测定试剂盒(2)利用埃里希体病原粗提取物的免疫学斑点ELISA检测(Biogal, Galed Laboratories)，以及利用来自主要合成肽免疫E.犬蛋白P30和P30-1的SNAP3Dx法(IDEXX Laboratories).
从疑似自然感染E. canis的以色列犬和人为感染病原的实验犬身上采集的样品做检测。比较定性结果（阳性或阴性），在IFA试验和三种ELISA试验中有74.6% (50/67 samples)的结果完全一致。6/17的样品结果不一致（假阴性结果），FIA浓度检测61:320。免疫学和 IDEXX 3Dx SNAP 试验有很高的专一性。（0.98和1.00，分别地）。作者总结出斑点ELISA试剂盒有特异性，并对于IFA浓度测定特别敏感,P1:320。为克服敏感性问题，在第一次抗体试验后，推荐1-2周重复ELISA试验。
3Dx SNAP 试验被用作每年的E. Canis临床筛查试验。但这一单独试验并不足以用于相关临床的判读，其结果还应与血小板数量和分子学结果结合。
CME血清学诊断可能存在另外几种埃里希体病原抗体与E. canis的交叉性反应。疑似的感染种类应针对犬居住地区和旅行史进行考虑。
E. Canis抗体与蠕虫新立克次体（N. Helminthoeca）和新立克次体的抗原交叉反应，相反，犬N. Helminthoeca抗原也对E. Canis抗体存在交叉反应。IFA不能区分E. Canis、伊氏埃立克体和反刍动物埃立希体的抗体。E. Canis抗体和嗜吞噬细胞无形体抗原的交叉反应被记载已久。在疾病的急性期，6只人工感染E. Canis 的犬抗体与嗜吞噬细胞无形体的抗原交叉反应失败。但是，感染后55天，在两只犬中，IgG抗体和嗜吞噬细胞无形体的抗原交叉反应首次被检测。感染后77天，检测到另两只犬的抗体交叉反应。最后两只犬在感染后150被检测到。
没有E. canis 和无形体platys（犬血小板热带无形体病病原）的血清学交叉反应，如果有的话，犬E. canis 和Rickettsia rickettsii（落基山斑疹热（RMSF）的病原）间的交叉性反应也会发生。由于这两种疾病相似的临床症状，有犬属埃里希体病原的临床症状，且血液检测阴性的犬，应进行RMSF 的检测。血清学结果的判读一定要结合既往病史和临床症状，有蜱虫传播多种感染的可能性，可能影响临床症状，和埃里希体病原的交叉性反应。

只羽千影

七又十分之九 发表于 2017-5-18 22:35
老师们能帮忙解解惑吗…是从犬粪便里面看到的，同时有钩虫

这是多少倍镜镜看到的，看外形像是结肠小袋纤毛虫滋养体

袁丽娟

也许两周前错过了一个病例，4岁混种犬，发烧，不吃，WBC1.1×10*9/L，几乎看不到血小板，红细胞5.99×10*12/L，正细胞正色素，后期吐血拉血

七又十分之九

老师们能帮忙解解惑吗…是从犬粪便里面看到的，同时有钩虫

齐旺财

谢谢老师分享

胡璠

我还是交给pcr检测吧

杨志祥

夏天到了，正好补补课

18005073860

每次看血涂片，都晕的不行

王帆

刘欣 发表于 2017-5-17 12:03
可以分早晚，两天完成。你可以的

那这样就人性化多了