【兽医肿瘤前沿】患有尿路上皮细胞癌的宠物犬的尿液和家庭化学品 ...

胡璠

患有尿路上皮细胞癌的宠物犬的尿液和家庭化学品暴露

翻译：张晨晨

 

摘要

人的尿路上皮细胞癌（UCC）与环境中的化学物质接触有关，但这些风险因素在患有UCC的犬中尚未得到充分了解。我们假设家庭化学品暴露会增加宠物犬患UCC的风险。这项前瞻性横断面病例对照研究包括 37 只患有 UCC 的犬和 37 只在品种、性别和年龄上与之匹配的未患病对照组。犬主人填写了一份环境调查问卷，并收集了家庭样本，对其中的砷（自来水和室内灰尘中）和丙烯醛（室内空气中）进行了分析。对 UCC 犬、对照组犬和同意的犬主人的尿液样本进行了无机砷、丙烯醛代谢物 3-HPMA 和苯氧除草剂 2,4-D 的分析。此外，还对病例家庭和对照家庭的城市饮用水中氯化副产物（总三卤甲烷）的公开数据进行了比较。与对照组的犬（0%）相比，患有UCC的犬更有可能在游泳池游泳（15.2%）（OR 1.69，95% CI = 1.69-∞; p = .02）。与对照组（中位数为 6.9 ppb；P < .0001）相比，患有 UCC 的犬的城市水中氯化副产物浓度（中位数 28.0 ppb）比对照组（中位数 6.9 ppb；p < .0001）高出 4 倍多。病例家庭的灰尘砷浓度（中位数为0.277ng/cm2）出乎意料地低于对照家庭（中位数为0.401ng/cm2；p =。0002）。其他结果在组间没有明显差异。这些数据表明，犬的主人，尤其是那些已知患 UCC 风险较高的犬种的主人，应考虑限制犬进入游泳池，并安装可去除总三卤甲烷的水过滤装置。

1引言

犬的尿路上皮细胞癌（UCC）是一种侵袭性癌症，可导致血尿、排尿困难和尿路梗阻。治疗经常会复发，这种疾病在犬中的死亡率很高。犬患膀胱癌的潜在原因尚不完全清楚。犬类的UCC与较高的工业活动区域有关，以及主人报告的除草剂和杀虫剂暴露情况。某些品种，如苏格兰梗，有很高的UCC风险。但是品种风险可能会受到环境因素的影响，例如报道的饮食中的绿叶蔬菜（风险降低）或接触苯氧基除草剂暴露（风险增加）。宠物犬测量了接触各种环境化学物质的情况，但是这些暴露的毒理学意义尚不清楚。

在UCC患者中，大约一半的病例是由吸烟引起的。然而，两项兽医研究发现，犬类UCC与报告的家庭吸烟活动之间没有关系。地下水中高浓度的无机砷与人类UCC聚集性有关，自来水中的氯化副产物也是如此。与对照组相比，人类UCC患者的尿砷浓度明显更高，但这还没有在犬身上进行过评估。

丙烯醛也是一种已知的尿路上皮致癌物并且存在于室内空气污染、烟草烟雾和一些热处理食品中。最后，苯氧基除草剂在流行病学上与农药施用者和宠物犬中的UCC有关，但是，在患有UCC的犬身上，还没有测量到直接的尿液暴露。

我们的总体假设是，家庭环境中的化学物质暴露会增加犬患UCC的风险。我们还假设，生活在同一个家庭的犬主人可能也会接触到这些环境中的化学物质。这项研究的主要目的是比较患有膀胱或尿道UCC的犬与匹配的未受影响的对照组犬的尿中无机砷、丙烯醛和苯氧基除草剂2，4-D的暴露量。第二个目的是确定测得的尿液化学物质浓度与潜在暴露源之间的关系。通过宠主对家庭环境问卷的回复解决了这一问题；直接测量自来水和家庭灰尘中的砷、室内空气中的丙烯醛和尿液中的可替宁（二手烟的标志）；以及城市饮用水中氯化副产物的公开数据。最终的目标是确定犬的尿液化学物质暴露较高是否与同一家庭的主人的尿液化学物质暴露较高相关。

2材料和方法

2.1病例和对照登记

患有UCC的犬是从威斯康星大学麦迪逊分校、科罗拉多州立大学和佐治亚大学教学医院招募的；通过在VCA网络上接触兽医肿瘤学家；并在2021年2月至2023年2月期间在Facebook上向品种协会和犬舍俱乐部发布广告。重要的是，我们还与Antech实验室合作，将我们的研究传单链接附在BRAF阳性检测结果上。该链接提供给管理兽医，鼓励他们与UCC的犬主人分享研究传单。感兴趣的犬主人直接向研究人员发送电子邮件，并使用IACUC批准和IRB批准的同意书通过电子邮件表示同意。同意的主人会送去为他们的犬（尿液）和他们的家庭（空气、灰尘和水）取样的工具包；如果受试者同意IRB方案，则还包括主人尿液的收集材料。所有试剂盒和采样材料都用去标识的研究编号编码。

UCC 的诊断依据是：(1) 下尿路体征；(2) 通过腹部超声波或其他成像方式在膀胱或尿道内发现肿块；(3) 组织病理学确诊或通过排出的尿液检测发现 BRAF 阳性。确诊的 UCC 病例可以是任何品种、年龄或性别/绝育状况。犬只在接受任何化疗或放疗之前入组；入组时可使用非甾体类抗炎药。

在 2021 年 2 月至 2023 年 2 月期间，从威斯康星大学麦迪逊分校的教学医院，以及通过在 Facebook 上向宠物主人、品种协会和犬舍俱乐部发布广告，招募临床未受影响的对照组犬只。对照犬与UCC犬按品种（或无特征的混合品种犬按体重）、年龄（1岁以内）、性别/绝育状态进行匹配。如果找不到同一品种的对照犬，则用近亲品种的犬作为对照犬。被选中了。对照组在入组前一年内不得有系统性癌症病史或未缓解的下尿路体征。我们试图在与病例相同的季节（即12月至2月、3月至5月、6月至8月或9月至11月）招募对照，以最大限度地减少因季节性暴露而产生的偏差，例如除草剂的使用。所有登记的病例犬和对照犬都必须与它们的主人在同一个家里生活了至少1年。

2.2家庭环境调查问卷

登记犬的主人被要求在登记前一年内完成一份与感兴趣的化学品相关的家庭暴露调查问卷。问卷包括四个部分:（1）犬的群体统计数据和主要居住地；（2）犬的生活环境，包括邻居的类型、驾车交通水平、家庭吸烟状况、犬洗澡的频率、除草剂的使用、壁炉或烧柴炉的使用、犬对游泳池的使用（可能含有氯化副产物），或存在压力处理过的木板（可能含有砷）；（3）犬的典型饮食和主要饮用水源；以及（4）关于所有者的群体统计信息、他们的主要饮用水来源以及在提供尿样前72小时吃的食物（因为丙烯醛和砷可以在一些食物中发现，这些接触可能与犬的饮食不同）。完整的调查问卷如图S1所示。

2.3饮用水中氯化副产物的城市数据

总三卤甲烷（TTHMs）是饮用水中发现的氯化副产物，它与人类的UCC病毒有关，在我们最近对一组感染UCC病毒的犬的单独研究中也发现了这种物质。通过环境工作组获得了关于城市饮用水中TTHM浓度的公开数据(https://www.ewg.org/tapwater/), 这是一家非营利性机构，负责汇编由公用事业公司提供的年度水监测数据。水数据的有效期为 2014 年至 2019 年。根据每个病例和对照组主要地址的邮政编码，使用每个邮政编码中列出的最大供应商记录城市饮用水中的 TTHM 浓度。

2.4尿液取样

虽然一些排泄的尿液样本是由兽医收集的，但大多数是由犬主人使用邮件中提供的试剂盒收集的。研究工具包中包含经 IACUC 批准和 IRB 批准的同意书副本（供犬主人记录）、家庭环境调查表、尿液取样用品、灰尘和水取样用品以及返回隔夜运输材料。主人被要求从他们的犬身上收集第一次晨尿（至少15毫升），并将样本放在冷袋中隔夜邮寄。如果所有者通过电子邮件同意这样做，他们还可以获得从自己身上获取排尿样本的材料。

2.5水、灰尘和空气取样

宠主使用威斯康星州立卫生实验室 (WSLH) 提供的家庭采样材料收集饮用水样本和灰尘擦拭物，以进行总砷测量。主人被要求从他们的犬的主要饮用水源中收集一个样本，放在一个4盎司的塑料瓶中。在收集样品之前，自来水运行2分钟；瓶装水或冰箱过滤水被直接收集。还向业主提供了一次性手套、25 cm × 25 cm纸模板和Ghost Wipe（SKC公司）的说明书，说明如何在一周不吸尘的情况下从主卧室的门槛获取灰尘样本。将除尘布放入 50 mL 锥形管中。所有样品均装在邮资已付的盒子中，隔夜邮寄至主要研究者的实验室。

研究人员收到研究样本后，向业主发送了一个6升的被动空气采样罐（Entech Instruments），以收集室内空气进行丙烯醛测量。宠主将罐放在厨房柜台上，打开采样阀收集空气，8小时后关闭阀门。罐子装在邮资已付的盒子中直接返回分析实验室（WSLH）。

2.6化学分析

对UCC犬、对照犬和同意养犬的犬主人的尿液样本进行了无机砷、3-HPMA（S3-羟丙基硫醇酸，丙烯醛的稳定代谢物）和苯氧基除草剂 2,4-D 的分析。所有尿液化学分析均由WSLH在收费服务的基础上提供。

如前所述，尿无机砷As[V]、As[III]及其代谢物二甲基砷酸(DMA)、单甲基砷酸(MMA)和三甲基砷氧化物(TMAO)采用高效液相色谱-磁扇区电感耦合等离子体质谱(SF-ICPMS)联用技术定量。

还使用SF-ICP-MS测量了水和灰尘中的总砷含量。在收到回执的当天，水样用硝酸（Optima，Fisher Scientific将1.2毫升16 M硝酸加入60毫升水中）并在分析前冷藏。在使用国家职业安全与健康研究所（NIOSH）方法7303进行分析之前，对灰尘擦拭样品进行消化，修改为仅使用硝酸（2.5毫升16 M溶液）而不使用盐酸。擦拭物经酸处理30分钟，然后加热至95℃保持1小时。

如前所述，尿液中的丙烯醛代谢物3-羟基苯丙酸甲酯被用液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)定量。空气中的丙烯醛在收集后30天内使用标准化的环境保护局气相色谱/质谱法(EPA修改为-15)进行批量测定。使用Entech 7200预浓缩器对罐内空气进行预处理，以浓缩样品并去除水和二氧化碳。最初的丙烯醛分析在WSLH进行；当这项服务不可用时，使用相同的EPA协议将后续样本送往东部研究小组（ERG）实验室进行分析。

使用商业ELISA试剂盒（Abraxis 2，4-D ELISA，Gold Standard Diagnostics，Warminster PA）测量尿液中的2，4-D。使用固相竞争ELISA方法（Abnova Corp .）测定尿可替宁。所有尿液化学物质都被标准化为尿肌酐，尿肌酐使用改良的动力学Jaffe方法（QuantiChrom肌酐检测试剂盒，BioAsssay系统）进行测量。

2.7统计分析

使用Wilcoxon配对符号秩检验，比较了配对病例和对照犬之间以及犬和人类主人样本之间的尿液化学物质（标准化为尿肌酐）。使用Mann Whitney检验比较了病例家庭和对照家庭的家庭暴露（空气丙烯醛、灰尘或水砷）和业主尿液中的化学物质（无机砷、3-HPMA和2，4-D）。使用Spearman等级相关系数，将犬只尿液中的化学物质浓度与家庭来源和主人尿液中的化学物质相关联。使用Kruskal–Wallis测试比较了不同采集季节的尿液中2，4-D浓度。

问卷数据被编码为分类变量；对除草剂品牌进行了搜索，以确定它们是否含有苯氧基除草剂2，4-D 。使用Fisher精确检验对病例和对照之间的分类问卷数据进行了比较，生成了优势比（ORs）和95%的置信区间。使用Mann–Whitney检验，按邮政编码对病例家庭和对照家庭报告的城市饮用水中的TTHM浓度进行了比较；报告主要饮用井水或瓶装水的家庭被从这些分析中删除。所有分析均使用商业软件（Prism，GraphPad Software LLC）进行，p<0.05被认为显著。选择p值<.20的变量进行共线性检验，使用方差膨胀因子和变量间的Fisher精确检验。

我们基于尿砷作为主要结果进行了先验样本量计算。我们使用了之前在另一群健康宠物犬中观察到的尿砷总量的可变性（50.1±37.8ng/mg cr）。以及人类UCC患者的尿砷总浓度，比对照样本高52%。这提供了每组35只犬的预测样本量（biopath.info）检测犬UCC病例和对照组尿砷的相似差异。

3结果

3.1群体统计学

最初总共招募了51只患有UCC病的犬。8只犬因诊断不完整或不兼容而接受审查，5只犬未归还试剂盒，1只犬在当前住所居住时间较短(3个月)，剩下37只符合条件的登记犬属于UCC。在与病例群体统计数据匹配后，对54只未受影响的对照犬进行了筛查。12只对照犬在登记后被审查，因为它们的匹配病例后来被排除在外，5只没有返回试剂盒，剩下37只合格的匹配对照犬。

最终研究群体包括多种品种（表1），病例组和对照组的入组年龄中位数为12岁。UCC犬和对照犬都由他们现在的主人拥有，中位数为11年（UCC为2-15.5年；对照，范围3.2-13.6年）。UCC犬在目前住所居住的年数中位数为4.8年（范围为1-12年），未受影响的对照犬为7年（范围为1-13.5年）。

表1。来自患有膀胱或尿道尿路上皮细胞癌（UCC）的犬以及未受影响的品种、性别和年龄匹配的对照组的群体统计学数据。

基础信息	UCC（n= 37)	对照(n= 37)
年龄中位数（范围）	12岁（8-16岁）	12岁（8-16岁）
性别
FS	21	22
FI	0	1
MN	13	11
MI	3	3
品种
喜乐蒂牧羊犬	4	4
未指明的混合	3	3
拉布拉多猎犬	3	3
短毛小猎犬	2	2
比格犬X	2	2
苏格兰梗	2	2
西高地白梗	2	2
澳洲牧羊犬	1	1
阿拉斯加克利凯犬	1	1
阿拉斯加哈士奇	1	1
万能梗	1	1
巴仙吉犬	1	1
比利时马利诺犬	1	1
牛头犬X	1	1
猎犬/猎狐犬	1	1
边境牧羊犬	1	1
德国牧羊犬	1	1
金毛猎犬	1	1
杰克罗素梗	1	1
马尔济斯犬/博美犬	1	1
马尔济斯犬/约克夏犬X	1	1
斗牛犬X	1	1
捕鼠梗犬	1	1
红骨猎浣熊犬	1	1
史宾格猎犬	1	1
威尔士梗	1	1
超声检查膀胱或尿道肿块	37	N/A
位置
顶端或颅背	13
三角区	13
膀胱未指明	6
仅尿道	3
腹侧或尾侧	2
细胞诊断		N/A
BRAF阳性	36
组织病理学a	1
样本采集季节	冬季 11（29.7%）	冬季 16（43.2%）
	春季10（27.0%）	春季8（21.6%）
	夏季9（24.3%）	夏季6（16.2%）
	秋季7（18.9%）	秋季7（18.9%）

缩写:FI，雌性未绝育；FS，雌性已绝育；MI，雄性未绝育；MN，雄性已绝育；X混合。

a 通过“创伤性”导尿获得的组织。

3.2家庭环境问卷调查结果

主人主要报告说他们的犬喝城市水和吃干犬粮，病例和对照组之间没有观察到差异（表2).病例组和对照组在报告的居住环境类型、驾车交通量、饮用未经过滤的水或井水、家庭吸烟、犬洗澡、使用壁炉或烧柴炉、是否使用经过处理的木板或报告的除草剂使用方面也没有差异（表3)。与对照组的犬相比，患有UCC的犬更有可能（15.2%）在游泳池中游泳，对照组的犬没有（0%）在游泳池中游泳的报道（OR 1.69，95% CI = 1.69–∞，p= .02;桌子3).

表二。来自患有尿路上皮细胞癌（UCC）的犬的主人和未受影响的品种、性别和年龄匹配的对照的选定家庭环境问卷答复。

类别	宠主答复	UCC n (%)	对照n (%)	OR	95% CI	p值
社区	受访者	37	36
	农村/农场	12 (32.4)	8 (22.2)
	城市/郊区	25 (67.6)	28 (77.8)	0.60	0.20–1.62	.60
交通流量a	受访者	37	37
	最低限度	11 (29.7)	14 (37.8)
	中度/重度	26 (70.3)	23 (62.2)	1.44	0.55–3.67	.62
水过滤	受访者	37	37
	是	16 (43.2)	19 (51.4)
	否	21 (56.8)	18 (48.6)	0.72	0.30–1.72	.64
家庭吸烟	受访者	37	37
	否	35 (94.6)	36 (97.3)
	是	2 (5.4)	1 (2.7)	2.00	0.22–29.7	>.99
在游泳池游泳（犬）	受访者	33	36
	否	28 (84.8)	36 (100.0)
	是	5 (15.2)	0 (0.0)	>1.69	1.69–∞	.02
洗澡（犬）b	受访者	33	36
	否	6 (18.2)	12 (33.3)
	是	27 (81.8)	24 (66.7)	2.25	0.77–7.31	.18
壁炉或烧柴炉	受访者	35	36
	否	23 (65.7)	24 (66.7)
	是	12 (34.3)	12 (33.3)	1.04	0.37–2.93	>.99
经过处理的木材或门廊	受访者	34	34
	否	23 (67.6)	15 (44.1)
	是	11 (32.4)	19 (55.9)	0.38	0.15–1.00	.09
除草剂的使用	受访者	36	37
	否	9 (24.3)	16 (43.2)
	是	27 (73.0)	21 (56.8)	2.29	0.85–6.10	.14
已知的	受访者	36	37
接触 2,4-D	未发现接触过 2,4-Dc	29 (80.6)	28 (75.7)
	已知接触过 2,4-D	7 (19.4)	9 (24.3)	0.75	0.26–2.36	.78

a 交通流量被定义为最小（死胡同或乡间小路）、中等（街区和地方道路）和严重（主要干道或高速公路）

b 定义为每月洗澡一次或多次。

c 结合非2，4-D除草剂、未指明的除草剂和未知的除草剂暴露。

表3。患有尿路上皮细胞癌（UCC）的犬和未受影响的品种、性别和年龄匹配的对照组的饮用水和饮食的主要来源。

类别	宠主答复	UCCn (%)	对照n (%)	OR	95% CI	p值
主要饮用水源	受访者	37	37
	非井水	31(83.8)	28 (75.7)
	城市的	27 (87.0)	24 (85.8)
	瓶装的	2 (6.5)	2 (7.1)
	其他的	2 (6.5)	2 (7.1)
	井水	6 (16.2)	9 (24.3)	0.60	0.18–2.00	.56
主要食物类型	受访者	36	37
	非粗粮a	8 (22.2)	5 (13.5)
	粗粮	28 (77.8)	32 (86.5)	0.55	0.18–1.70	.37

a结合了罐头、生食和家常饮食。

所有在游泳池游泳的犬（n= 5）也每月洗澡一次以上，尽管游泳和频繁洗澡在这个小群体中没有显著关联（p= .31)。我们测试了以下分类变量的共线性:在游泳池游泳、每月洗澡一次或更多次、家庭使用经过处理的木材或门廊以及报告的除草剂使用情况。我们没有发现基于不同通货膨胀因素（均接近1）和Fisher确检验的变量之间存在显著的共线性。

与对照组相比，UCC 犬居住的邮政编码区的城市自来水中 TTHM 浓度（中位数 28.0 ppb，范围 0.4–57.8 ppb）高出 4 倍多（中位数 6.9 ppb，范围 1.8–38.3 ppb；p < . 0001；图 1)。

 

图1

在患有尿路上皮细胞癌的犬（UCC）和未受影响的匹配对照组的居住区，报告的城市饮用水中的三卤甲烷（TTHMs）（来自2014-2019年邮政编码区的公共供水数据）。组间 p < .0001

3.3无机砷暴露

与对照组相比（中位值 0.41 nmol/mg creat，范围 0.02-3.65 nmol/mg），UCC 病例中尿总无机砷 (iAs) 浓度（中位 0.65 nmol/mg creat，范围 0.08–6.33 nmol/mg creat）没有显着升高。创建；p = .19；图 2)。与这些发现一致，病例家庭和对照家庭的家庭饮用水总砷浓度没有差异（中位数分别为0.16和0.16μg/L；p= .98;图3A).所有犬的尿iAs浓度与饮水总砷浓度不相关（r= .21,p=。18）。

 

图2

与未受影响的对照组相比，尿路上皮细胞癌（UCC）患者犬尿液中无机砷总量（iAs）的测量浓度。

 

图3

图A:在患有尿路上皮细胞癌（UCC）的犬和未受影响的对照组的家庭饮用水中测得的砷浓度。图B:UCC病例和未受影响的对照组家庭灰尘中测得的砷浓度。

与对照家庭（中位数 0.40 ng/cm2；p = .0002；图 3B）相比，病例家庭的灰尘砷浓度显着较低（中位数 0.28 ng/cm2），这与我们的假设相反。所有犬的尿液 iAs 浓度与灰尘总砷浓度无关（r = .12，p = .44）。

与对照犬主人相比（中位值 0.12 nmol/mg creat，范围 0.05-2.40 nmol/mg creat），UCC 犬主人的尿总无机砷浓度略低（中位 0.08 nmol/mg creat，范围 0.04–1.09 nmol/mg creat） ；p = .053；图 4），这也与我们的假设相反。总体而言，人类主人尿液中的iAs浓度（中位数为0.08 nmol/mg creat，范围为0.04–0.33）显著低于宠物犬（中位数为0.30 nmol/mg creat，范围为0.02–3.63 nmol/mg creat；p < .0001), 并且它们彼此不相关 (r = -18, p = .19) 或与饮用水中的砷 (r = -25, p = .17) 或灰尘 (r = .20, p = .29) 相关。

 

图4

尿路上皮细胞癌（UCC）犬的主人与未受影响的对照犬的主人尿液中的无机砷总量（iAs）的测量浓度。

3.4丙烯醛暴露

尿中丙烯醛代谢物3-HPMA浓度在UCC病例组(中位数为2136nmol/mg creat，范围为381-15536nmol/mg creat)与对照组(中位数为1802nmoL/mg creat，范围为81-7495nmol/mg creat；p=0.78；图5A)之间没有显著差异。

 

图5

图A:患有尿道细胞癌 (UCC) 的犬和未受影响的匹配对照组的尿液中丙烯醛代谢物 3-HPMA 的浓度。图B:UCC 家庭与对照组家庭室内空气中平均八小时丙烯醛浓度的比较。图C:患有尿路上皮细胞癌的犬的主人与未受影响的对照组犬的主人的尿液中 3-HPMA 的浓度比较。对61个家庭进行了空气丙烯醛含量测量。31个病例家庭(中位数0.53 ppbv，范围0.06-2.64 ppbv)和30个对照家庭(中位数0.70 ppbv，范围0.06-1.79 ppbv；p=.31；图5B)的空气丙烯醛浓度相似。犬尿3-HPMA浓度总体上与空气中丙烯醛浓度没有显著相关性(r=-.13，p=.32)，但由于研究设计的原因，这些测量不是在同一天获得的。

38名犬主人提供了尿中3-羟甲基丙酸的数据。与我们的假设相反，UCC犬主在单个时间点的尿3-HPMA浓度(n=23；中位数217 ng/mg creat，范围62-9123 ng/mg creat)显著低于对照组(n=15；中位数347 ng/mg creat，范围49-1909 ng/mg creat；p=.047；图5C)。

人类尿中3-HPMA浓度(中位数269 ng/mg creat，范围49-9123 ng/mg creat)显著低于犬3-HPMA浓度(中位数1904 ng/mg creat，范围81-15 536 ng/mg creat；p<0.0001)，且与犬尿3-HPMA(r=-13，p=.45)或空气中丙烯醛浓度(r=.29，p=.10)均无相关性。

3.5尿2，4-D

UCC病例组和对照组的尿2，4-D浓度差异无统计学意义(中位数16.4 ng/mg creat，范围7.2-84.0 ng/mg creat)和对照组(中位数16.5 ng/mg creat，范围9.1-35.2 ng/mg creat；p=.88；图6A)。有趣的是，与报告不使用2，4-D除草剂的家庭(中位数16.40 ng/mg Creat，范围7.2-82.8 ng/mg creat；p=.97)相比，报告使用2，4-D除草剂的家庭之间的尿2，4-D浓度没有显著差异(中位数为17.9 ng/mg creat；范围为10.2-84.0 ng/mg creat；p=.97)。令人惊讶的是，所有犬的尿2，4-D浓度并没有随采集季节的不同而变化(p=0.49；图S2)。

 

图6

图A:患有尿路上皮细胞癌（UCC）的犬和未受影响的匹配对照组的尿液2，4-D浓度。图B:患有尿道细胞癌的犬的主人与未受影响的对照组犬的主人尿中 2,4-D 的浓度比较。

患有UCC的犬的主人和对照犬的主人之间的尿液2，4-D浓度没有显著差异（p= .18;图6B)。与砷和丙烯醛不同的是，犬的尿液2，4-D浓度（中位数为16.5ng/mg creat）与主人的尿液浓度（中位数为14.6 ng/mg）相比并没有明显升高；犬和主人的尿液中2，4-D含量没有相关性（p=.71)。

3.6尿可替宁

仅在一只患有UCC的犬中检测到尿可替宁；该宠主还报告在家中吸烟，并在自己的尿液中检测到可替宁（表4)。三只对照犬有可检测到的尿可替宁，但其中只有一只主人报告在家中吸烟。由于吸烟家庭的数量很少，我们无法在这个犬群中确定吸烟是UCC的危险因素。

表4。有证据表明患有尿路上皮细胞癌（UCC）的犬暴露于烟草烟雾的家庭以及未受影响的品种、性别和年龄匹配的对照组。

家庭ID	犬尿可替宁（ng/mg creat）a	宠主尿可替宁（ng/mg creat）	屋内吸烟？
UCC家庭n= 5
16	ND	0.5	是
19	0.3	3.5	是
24	ND	ND	否，但吸食尼古丁
25	ND	9988	否，但每周在外抽 2-3 支烟
26	ND	ND	不，但每周在外抽 9 支烟
对照家庭n= 3
51	2.0	NA	是
61	4.7	NA	否
62	88.4	NA	否

a ND:未检测到；校正尿肌酐之前，可替宁检测的检测限为5 ng/mL。NA:不可用（未提交所有者尿液）。

4讨论

在这个病例对照研究中，我们发现在游泳池游泳是犬患UCC的一个重要风险因素。氯化水中可能含有具有致突变性的活性分解产物（三卤甲烷，尤其是溴仿）。氯化副产物与人体内的UCC有关，尤其是通过游泳、洗澡和淋浴。虽然与UCC患者的流行病学研究一致，但我们在犬中的发现应在更大的人群中得到证实，以及与游泳池使用相关的其他可能未测量的协变量，如社会经济地位。

三卤甲烷具有挥发性，需要专门的收集方法，因此我们无法通过远程登记方案从单个家庭饮用水样本中获得准确的三卤甲烷浓度。因此，我们使用了按邮政编码排列的城市饮用水源中总TTHM浓度的公开数据。我们发现，与未受影响的犬相比，UCC犬生活在城市饮用水中报告的TTHM浓度较高的地区。这与我们之前在单独的UCC病例对照犬群中的发现是一致的，和我们的游泳池数据一起，支持了接触TTHM可能导致犬患UCC风险的假设。

尽管在我们的犬类中，洗澡频率与UCC没有明显的关联，但每月至少洗澡一次是病例中最常见的特征(82%，而对照组为67%)。频繁洗澡是接触氯化副产品和可能的跳蚤产品杀虫剂的另一个可能来源；应该在更大的群体中探索这一点。

 

与对照组相比，我们没有发现犬UCC病例的尿iAs浓度显著升高。相反，一项荟萃分析发现，人的总体尿iAs百分比与UCC呈正相关。具体而言，在台湾的一项基于医院的研究中，人类膀胱癌患者的尿液iAs百分比显著高于对照组（约50%）。我们使用后一项人类研究来估计犬类研究的样本量，虽然我们也观察到病例组的尿砷浓度比对照组高约50%，但这在我们的犬类群体中并不显著。这可能部分是由于与之前的人类研究相比，在犬类病例中观察到的尿砷浓度差异更大。一项特殊的样本量计算预测，我们将在每组中需要278只犬来克服这种差异，并证明犬UCC病例和对照组之间的尿砷显著增加。随着时间的推移，通过收集几个尿样，或者也测量头发样本中的砷，可以减少差异，这可以反映犬的低到中等慢性无机砷暴露。

与对照家庭相比，病例家庭测得的饮用水砷浓度也没有升高。饮用水中的砷，尤其是从年代久远或挖得较浅的私人水井中获取的砷，是人类感染UCC的一个风险因素。据报道，总共有15只犬在喝井水，但我们没有关于井水类型或年龄的数据，也没有其他犬在一生中是否喝过井水的数据。在未来的研究中，这些数据将是重要的。

我们还测量了家庭灰尘中的砷，因为重金属会污染室内灰尘，并成为人类（可能还有犬类）暴露的储存库。与我们的假设相反，病例家庭的粉尘砷浓度显著低于对照家庭。在我们的调查问卷中，我们没有询问宠主多久吸尘一次或是否使用空气净化器。有可能对犬类UCC的诊断导致了相关犬主人的持家习惯改变。一项针对人类的研究表明，空调过滤灰尘比地板灰尘更容易被砷污染，因此，在后续研究中，测量空气过滤设备或真空吸尘器袋中灰尘中的砷可能是一种更敏感的方法。

UCC犬主人的尿砷浓度明显低于健康犬主人的尿砷浓度，这是出乎意料的。然而，绝对差异很小（0.082对0.118 nmol/mg creat），这可能反映了日常变化，但没有毒理学意义。包括犬主人在内的后续研究也可以考虑包括每个人类受试者的毛发样本。

无论是通过测量尿液中的3-HPMA代谢物还是8小时厨房空气中的丙烯醛浓度，我们都没有发现该人群中UCC病例的丙烯醛暴露水平显著升高。值得注意的是，所有犬的尿液中均可检测到丙烯醛代谢物，其范围与最近在其他健康犬中报告的范围相当（范围为90–7420纳克/毫克肌酐）。甚至在生活在不吸烟家庭的犬中也检测到了丙烯醛代谢物，这表明丙烯醛暴露的替代来源，如环境空气污染、热处理食品或室内烹饪。我们没有具体说明应该在什么8小时内收集空气（例如，在烹饪或不烹饪时），我们的样本可能无法代表我们人群的慢性室内丙烯醛的情况。

对人类来说，丙烯醛暴露和UCC之间的联系在某种程度上是间接的。丙烯醛是已知的人类尿路上皮细胞诱变剂和啮齿动物尿路上皮致癌物，包含在香烟烟雾中，这是人类UCC的主要风险因素，并且是环磷酰胺的毒性代谢物，环磷酰胺也与人类UCC有关。然而，只有一项研究评估了膀胱癌患者尿液中稳定的丙烯醛代谢物3-HPMA，并且没有发现UCC患者的显著增加。建议对丙烯醛暴露随时间的变化进行更全面的评估，例如血浆中的丙烯醛-蛋白质结合物，或者可能是硅胶被动取样器。

尿液中的2，4-D暴露与其他人用ELISA法在健康犬尿中检测到的结果相似，但比用HPLC/MS-MS测得的结果高3倍以上。酶联免疫吸附试验还可能检测到其他2，4-D代谢物或除草剂同系物。与对照组相比，患有UCC的犬的尿液2，4-D浓度并没有显著升高，至少在单个时间点测量时如此。我们无法按照采集月份完美匹配病例和对照，尽管尿液中2，4-D浓度在不同季节没有显著差异，但除草剂季节性使用的差异仍可能会混淆我们的结果。尽管样本是在同一天采集的，但犬及其主人尿液中的2，4-D浓度并不相关。原因之一可能是2，4-D在犬体内的消除半衰期较长（99-134小时）与人相比（~12 h）。在未来的研究中，应考虑收集全年多日的尿液样本。

我们的研究设计有几个局限性。首先，尽管在全国范围内招募，我们的最终样本量仍然很小。只有在兽医做出明确诊断后，才能登记犬只病例，因此我们无法评估许多低收入家庭犬类的化学物质暴露情况。这一点很重要，因为在社会经济水平较低的农村社区和家庭中，空气污染物、饮用水中的砷甚至家庭灰尘中的砷的浓度都更高。

我们还受到预算和尿量的限制，无法调查尿液中化学物质暴露的数量。其他感兴趣的化学物质包括全氟和多氟烷基物质（PFAS）和芳香胺，这两种物质在流行病学上都与人类膀胱癌有关。不幸的是，PFAS在血液中比在尿液中更容易检测到，血液采集会为我们的宠物主人增加一个额外的招募步骤。我们之前测量了健康宠物犬尿液中的芳香胺4-氨基联苯，发现大多数犬的浓度低于或接近定量极限。未来的研究可以评估芳香胺苯胺和o-甲苯胺，也与人的职业性膀胱癌风险有关，最近在健康犬的尿液中发现了这种物质。

我们应该在问卷中包含更多关于家庭杀虫剂使用的详细问题。我们和其他人发现家用杀虫剂的使用与犬的膀胱癌有关，最近在健康犬的尿液中发现了多种杀虫剂，包括烟碱类、拟除虫菊酯类和有机磷类。在未来的研究中，应考虑直接测量尿液杀虫剂暴露量。

与对照组相比，我们在犬UCC病例中观察到尿无机砷和3-HPMA的总浓度略高，但均未达到显著水平。虽然这可能是由于我们的样本量较小，但事后样本量计算估计分别需要537例病例和527例对照，或896例病例和896例对照，以证明这些观察到的微小差异具有显著性。

我们的横断面采样协议假设单个时间点的测量值可以作为慢性化学暴露的替代值。在人类膀胱癌研究中，单时间点化学测量对结果关联很敏感，尽管样本量更大。随后的研究可能包括头发样本中砷含量的测量和和血浆中的丙烯醛-蛋白质缀合物，以提供随着时间推移而暴露的更综合的衡量标准。

总之，我们发现犬类UCC与游泳池使用和城市饮用水氯化副产物浓度较高之间存在显著关联。这些发现与UCC在人群中的研究相一致，可能代表了因果风险因素。如果是因果关系，我们的研究结果将支持以下建议，即犬的主人饲养UCC风险较高的品种，如苏格兰梗、喜乐蒂牧羊犬和西高地白梗犬，限制他们的犬进入氯化游泳池，最重要的是，考虑安装能够去除三卤甲烷的室内水过滤装置。

曾医生

陈澄

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杨先生

南海

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