【兽医肿瘤前沿】抑制性检查点分子mRNA在犬软组织肉瘤中的表达 ...

胡璠

抑制性检查点分子mRNA在犬软组织肉瘤中的表达

翻译：徐晋

 

摘要

犬软组织肉瘤 （STS）是常见的肿瘤且被认为是免疫荒漠。肿瘤内浸润淋巴细胞在STS中是稀少的，当存在时，倾向于在血管周围或肿瘤周围组织。这种模式与PD轴分子过表达相关的免疫抑制肿瘤微环境有关。PD-1、PD-L1和PD-L2的表达与人类和犬的其他肿瘤的恶性和不良预后相关，但对它们在犬STS中的作用、它们与肿瘤分级的关系以及不同治疗方法如何影响表达知之甚少。本研究的目的是评估检查点分子在STS各个肿瘤级别和肿瘤消融治疗后的表达。通过逆转录酶实时定量PCR对软组织肉瘤组织切片和来自弗吉尼亚理工大学动物实验室服务档案的STS组织标本进行基因表达分析。在未治疗的1、2和3级STS组织中检测PD-1、PD-L1和PD-L2的表达。相对于未治疗的肿瘤区域，从治疗界面取样的组织中观察到数值上所有标记物的表达减少。这些检查点分子在治疗区域外围相对较低的表达可能与组织摧毁术治疗诱导的液化性坏死有关，并可能使肿瘤浸润淋巴细胞浸润肿瘤。这些检查点分子在高级别肿瘤和免疫细胞浸润中相对增加，这与先前的报道一致，即它们的表达与恶性肿瘤有关。

 

1 简介

在依靠手术、化疗和放疗等传统方法治疗癌症多年后，免疫疗法的引入彻底改变了这一领域，有望为人类和犬带来许多好处。在人类，最成功的免疫疗法是那些旨在阻断程序性死亡-1（PD-1）及其配体PD-L1和PD-L2之间相互作用的疗法。PD-1是一种在耗尽的T细胞中表达的抑制性免疫受体。PD-L1经常在恶性肿瘤细胞上高水平表达，当这种配体与T细胞上的PD-1受体结合时，导致免疫耐受，使肿瘤发展和转移率增加。在过去的几年中，对犬黑色素瘤的类似治疗的尝试已有了肿瘤大小减小、生存时间延长和完全缓解的报道。人体免疫治疗的疗效与肿瘤微环境 （TME）的免疫谱密切相关。较好的结果通常与“热”肿瘤相关，“热”肿瘤定义为T细胞浸润和免疫刺激细胞因子水平增加；而这些疗法对“冷”肿瘤的疗效较差，“冷”肿瘤维持免疫抑制TME，T细胞浸润水平低。

软组织肉瘤 （STS）在犬很常见，占所有皮肤或皮下肿瘤的15%。它们是一组不同的间质肿瘤，具有相似的特征：切除困难，复发率高，高达30%的病例可发生转移。导致预后较差的因素是有丝分裂计数高、多形性增加、有坏死区域和肿瘤大小大于5cm。STS通常根据Trojani等人提出并经Dennis等人修改的指南进行分级。简而言之，根据肿瘤的分化程度给出1-3分，根据有丝分裂计数给出1-3分，根据肿瘤内坏死程度给出0-2分。

STSs长期以来被认为是免疫沙漠且不适合免疫治疗。然而，最近的研究报道肿瘤内浸润淋巴细胞 （TILs）的浸润取决于肿瘤类型，高度突变的肿瘤具有更高的免疫原性。PD-L1的表达在人类STS中已有描述，并与不良预后和较短的生存时间相关。相反，对这种检查点分子在犬癌症中表达的评估却很少。在STS中，只有一项报道指出，11例血管肉瘤中有2例PD-L1免疫阳性，8例恶性纤维组织细胞瘤中有6例，11例恶性神经鞘肿瘤中有4例，10例血管外皮细胞瘤中有4例，6例纤维肉瘤中有4例。 也有报道PD-L1在一组9只患有恶性间充质肿瘤的犬的血清中，这些肿瘤的诊断包括骨肉瘤、脂肪肉瘤、皮肤血管肉瘤、纤维肉瘤和平滑肌肉瘤。

无论肿瘤的免疫状态如何，大多数治疗的目标不仅是摧毁癌细胞，而且还将肿瘤抗原释放到TME，以促进免疫系统在原发部位和循环中对其的识别，统称为远位效应。这种方法在人类STS中是成功的，因为增加了这种相当“冷”的肿瘤的免疫原性，增强了T细胞的识别和后来的肿瘤破坏，使联合免疫疗法比单一疗法具有优势。

替代性局部肿瘤消融术在过去六年中得到了发展。这些疗法的目标是作为一种侵入性较小的技术能针对癌细胞、尽可能多地保留健康细胞。肿瘤消融治疗包括射频消融、微波消融、激光、高强度聚焦超声、冷冻消融、不可逆电穿孔和组织摧毁术。前六种方法依赖于极端温度来消融肿瘤组织，而组织摧毁术是第一批非电离和非热消融图像引导治疗方法之一。微秒脉冲的声波压力使组织内形成微泡，产生机械应力，并以精确的边缘液化邻近的癌细胞，从而保留关键的正常结构，如神经和大血管。均质和液化的组织含有保留抗原性的天然肿瘤抗原，这可能促进异位或远端免疫反应，并可以通过增加树突状细胞对抗原的识别和模式识别受体（包括toll样受体）对损伤相关分子模式的识别来抑制转移过程，模式识别受体为细胞因子级联提供促进炎症的细胞因子。在先天免疫系统的初始反应后，CD8+细胞毒性和CD4+辅助性T细胞被激活，并可以通过循环到达肿瘤部位与肿瘤细胞相互作用。

虽然最近在犬癌症中描述了组织摧毁术后的免疫反应，但报道仍然有限，特别是在STS中只有一项报道。对组织学的适应性反应目前正在研究中，PD轴的检查点分子在治疗后的表达相对未被探索。随着免疫疗法在人类医学中的发展，迫切需要更多的努力来深入了解兽医癌症病患的治疗，并更好地了解免疫疗法如何作为肿瘤消融治疗的单一疗法或辅助疗法。据我们所知，这是第一个描述检查点分子在犬STS中表达的报道。

 

2 材料与方法

2.1 组织样本

本研究选择的病例包括两个不同的组。一组包括从弗吉尼亚理工大学动物实验室服务中心 （ViTALS）的档案中选择的29例软组织肉瘤病例，代表了几种公认的STS组织型 （补充表1）。这些肿瘤活检来自不同的私人养犬，提交常规组织病理学评估。1级和2级病例均从2021年起。3级病例分别来自2019年（3）、2020年（1）和2021年（5）。根据Trojani等人提出的、Dennis等人2011年修改的指南，软组织肉瘤的诊断进一步分为1级、2级和3级。简单地说，根据肿瘤的分化程度从1到3分，根据有丝分裂计数从1到3分，根据肿瘤内坏死程度从0到2分。形态学检查淋巴血管浸润情况。按照这个分类系统，10例为1级，10例为2级，9例为3级。

第二组病例来自Ruger等人的临床研究，该研究旨在确定10例犬软组织肉瘤病患组织摧毁术的安全性和可行性。组织摧毁术纳入标准为细胞学或组织学诊断为软组织肉瘤且未接受过治疗的病患。复发肿瘤未被排除。组织摧毁术治疗后4至6天进行切除活检，并提交给具有丰富评估消融肿瘤组织经验的兽医病理学家评估，组织切片用福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE）块保存。目前的研究选择从治疗界面区域收集的组织切片 （补充图1）和从每个病患的肿瘤远端未治疗区域收集的组织切片进行分析。

 

2.2 实时定量聚合酶链反应 （RT-qPCR）

从49个病例中每个病例的FFPE块上连续切下10个厚度为10微米的卷轴。RNA提取和cDNA合成使用市售试剂盒 （分别为Qiagen RNA提取试剂盒和Life Technologies High Capacity cDNA试剂盒）根据制造商的指南进行。RT-qPCR分析使用先前验证过的引物和探针，这些引物和探针跨越变异保守的外显子-外显子连接，在Stevenson等人描述的三个20 ul反应中进行。对于PD-L1和PD-L2靶标，有效标记的引物和TagMan探针浓度分别为0.3 uM和0.2 uM；犬PD-1和内部参考标记18S rRNA的引物和探针套装从ThermoFisher 公司获得（编号分别为4351372和4333760F），按照供应商的建议使用。TaqMan快速通用PCR Master Mix （ThermoFisher cat. no. 4366073）用于所有反应。设置阴性对照包括未添加模板或包含非逆转录RNA，以确认观察到的qPCR信号归因于cDNA的存在。

对于每个样本，首先将每个靶标的平均Ct值用18S rRNA表达内部归一化（得到ΔCt），然后将相同靶标在1级肿瘤（上述第一项研究）或未治疗肿瘤（第二项研究）中的平均归一化表达进行比较，得到ΔΔCt。为了呈现，结果被计算为相对于作为对照的各组平均表达的倍数变化（）。

 

2.3 免疫组织化学

使用抗CD3（泛T细胞标记物）和FoxP3 （调节性T细胞标记物）的抗体，对所有10例来自组织摧毁术临床研究的病例进行免疫组织化学分析，包括治疗界面和未处理的组织切片。每个FFPE组织取5 μm切片脱蜡，用CD3单克隆抗体 （Dako克隆A0452；1:100）和抗HuFoxP3 （eBio clone 7979；1:100）染色。使用通用碱性磷酸酶红色检测试剂盒 （Ventana UltraView）作为二抗，用Fast Red显色剂孵育使抗体可视化。载玻片在弗吉尼亚理工大学动物实验室服务部（AAVLD认证的兽医诊断实验室）的自动Ventana Benchmark XT上使用标准协议进行处理。免疫组织化学分析的孵育条件详见补充材料。每个细胞标记物的阳性对照来自结肠和淋巴结组织。未加一抗染色的软组织肉瘤切片作为阴性对照。用苏木精复染。16个组织切片的评估和特征描述由一名委员会认证的兽医病理学家以盲法进行，计数浸润肿瘤的各个免疫阳性细胞，平均超过10个高倍视野（HPF；2.37 ）。

 

2.4 统计分析

通过Shapiro-Wilk检验评估单个检查点分子相对表达数据分布的正态性 （值）。如果数据不是正态分布，则使用非参数Kruskal-Wallis检验 （Dunn检验用于校正多重比较）或双尾非配对非参数Kolmogorov-Smirnov检验进行组间比较。双侧t检验用于比较未治疗和超声治疗肿瘤中检查点分子的表达。采用最小二乘线性回归评估CD3+和FoxP3+丰度与各检查点分子相对基因表达的关系，方差分析计算非零斜率具有统计学意义。回归的相关系数（r）用来估计两个变量之间的关联程度。当p值< 0.05时，认为结果有统计学意义。全部采用Prism 9.4（GraphPad软件）进行统计分析。

 

3 结果

3.1 抑制性检查点分子在1、2、3级软组织肉瘤中的表达

采用从29个FFPE软组织肉瘤组织块中提取的总RNA，对PD-1、PD-L1和PD-L2进行RT-qPCR分析。每个标本的结果均表达为检查点分子mRNA、用18S rRNA内部归一化，并相对于1级组织切片的平均归一化表达 （）。

检查点分子mRNA在软组织肉瘤中的表达模式随分级增加有所不同 （图1）。PD-1的平均表达随肿瘤分级增加而增加，1级相对于3级有统计学意义 （图1A；P = 0.0142）。有趣的是，与3级相比，2级中PD-L1的相对表达量具有统计学意义 （p = 0.027），但1级和3级之间的表达量无统计学意义差异 （图1B）。PD-1和PD-L2 mRNA的表达随着肿瘤分级的增加而增加，但这些变化没有达到统计学意义。

为了评估软组织肉瘤间变与感兴趣的抑制性检查点分子表达之间的关系，根据肿瘤的分化程度对所有组织切片进行重新分类。使用Dennis等人建议的评分系统，仅根据分化程度对所有切片进行评估。当细胞与正常组织基本相似时，样本的评分为：1 =轻度，细胞与正常组织大体相似；2 =中度，有可识别的软组织，但与正常组织只有细微的相似之处；3 =显著，肿瘤细胞未分化。分类后，将这些分数与PD-1、PD-L1和PD-L2的表达进行比较。在分化程度较高的肿瘤中，PD-1和PD-L2的表达量在数值上较高，而无论分化程度如何，PD-L1的基因表达量在数值上保持相似（图2）。未观察到统计学上显著不同的组间差异（Kruskal-Wallis）。

 

3.2 抑制性检查点分子在组织摧毁术临床试验的软组织肉瘤中的表达

PD-1、PD-L1和PD-L2基因表达的测量方法如上所述，使用从20个组织切片中提取的RNA，每个STS病患2个组织切片：来自接受组织摧毁术治疗的软组织肉瘤的10个治疗界面区、10个未治疗区（图3）。每个标本的计算结果为检查点分子mRNA，用18S rRNA内部归一化，然后相对于未治疗组织切片中的平均归一化表达（）。与未治疗的肿瘤区域相比，治疗界面上所有3个检查点分子的表达量在数值上都较低，但没有达到统计学意义（Kolmogorov-Smirnov检验）。

 

3.3 免疫组织化学

为了评估组织摧毁术治疗对局部TME中TILs存在的影响，采用免疫组织化学方法以CD3作为标记识别T淋巴细胞，以Foxp3识别T调节细胞 （图4）。

虽然没有统计学上的显著变化，但与未处理的切片相比，处理界面的切片中CD3+和Foxp3+细胞浸润的证据在数值上较低 （p分别= 0.97和0.23，通过Kolmogorov-Smirnov检验；图5）。

通过协方差分析来评估检查点分子的表达与CD3和Foxp3阳性细胞浸润之间的关系。所有六条曲线均显示正相关系数 （r）值，表明这些检查点分子的表达与CD3和Foxp3阳性细胞的浸润呈正相关关系 （即斜率为非零的回归曲线）（图6）。

 

4 讨论

本研究评估了来自2组FFPE组织切片的PD轴 （PD-1, PD-L1和PD-L2）的检查点分子的基因表达。第一组，从ViTALS档案中获得，包括来自STS 1级、2级和3级的组织切片，其中我们预测更高级别肿瘤中检查点分子的表达增加。与这一预测相一致的是，与1级相比，3级病患的PD-1表达有统计学意义上的显著增加。2级STS中PD-L1的表达高于1级STS， 3级STS中PD-L1的表达高于1级STS。PD-L2的平均相对表达随着肿瘤级别的升高而升高，但没有达到统计学意义。尽管我们的假设预料到了这种检查点分子增加的模式，但3级STS的PD-L2维持与2级相当的水平，而PD-L1恢复到与1级相当的水平。

PD-L2在不同程度未分化的STS中的基因表达表明了其潜在的重要性。未分化程度越高的STS在数值上PD-1和PD-L2的表达越高，而PD-L1的表达在3个未分化分类中保持相似。总之，这些发现提示了调节这两种配体表达的潜在不同机制，并强调了PD-L2在恶性肿瘤中可能发挥的作用。

PD-L2的高表达已在人类生殖系统癌、食管癌、一些软组织肉瘤、骨肉瘤等肿瘤中被报道，它与肿瘤细胞的存活、迁移和对化疗的耐药性有关。与PD-L1不同，PD-L2不需要改变构象来结合PD-1，与PD-L1相比，PD-L1对PD-1的亲和力更高。然而，与PD-L1相比，对PD-L2的研究并不彻底，大多数已发表的研究结果都集中在PD-L1上。虽然关于PD-L2在治疗反应和预后中的作用的报道有时是相互矛盾的，但最近对人类肿瘤的研究将其表达与不良预后联系起来。更重要的是，这种检查点分子在犬肿瘤中的表达一直被忽视，只有在犬黑色素瘤中的唯一报道。这些结果显示PD-1受体和PD-L2配体都有增加的趋势，这支持了先前的报道，即恶性程度较高的软组织肉瘤通常有较多的免疫细胞浸润，但仍被认为是免疫抑制。然而，需要更多的数据来支持这些发现，并更彻底地确定PD-L2在犬肿瘤TME中可能发挥的作用及其与临床结果的关系。

人们已经做出了很大的努力来研发不同的治疗癌症的方法。然而，关于这些疗法如何影响免疫系统和调节TME的报道在人类医学文献中很少，在某些情况下，肿瘤可能会适应在治疗后上调的PD-L1表达。本研究评估的第二组是10例STS患犬的组织摧毁术临床试验中治疗前后的组织切片。从治疗界面和肿瘤未治疗区域收集组织切片。我们预测，从治疗界面获得的切片上，检查点分子的表达较低，这一预测在分析的三个检查点分子中得到了证实。

在免疫组化分析中，在肿瘤未治疗区域的组织切片中观察到较少数量的CD3+和Foxp3+细胞。此外，我们的免疫组化分析显示CD3+和Foxp3+细胞的浸润与PD轴检查点分子的表达呈正相关，正如之前在犬黑色素瘤中报道的那样。Ruger等人对IBA1+/CD206+（促炎）巨噬细胞进行了评估，报道了这些细胞在治疗界面的切片中向治疗区域增强。作者还报道，在治疗间期和未治疗区域的巨噬细胞都缺乏iNOS，通常伴有PD-L1的高表达（通过细胞因子如肿瘤坏死因子α的作用）。考虑到这些发现，研究的时间线可能更倾向于评估先天反应而不是适应性反应。然而，PD轴表达的局灶性降低会促进淋巴细胞未来的浸润。

值得注意的是，PD-L1可以由癌细胞以外的细胞表达，如树突状细胞和巨噬细胞，作为其正常免疫稳态活性的一部分。另一方面，PD-L2可以通过巨噬细胞、肿瘤细胞和TME间质表达。由于缺乏针对犬肿瘤这些检查点分子的市售抗体，我们在TME中定位PD轴分子的能力受到限制，因此需要进一步的研究来确定PD-L2的表达并评估其对肿瘤恶性特征的贡献。然而，检查点分子在高等级STS中的高表达表明其在这一过程中具有重要作用，可通过对这些接受组织摧毁术的病患的随访进一步研究，因为其高表达通常与较短的生存时间和较差的预后相关。CD3+淋巴细胞在未治疗区域的存在，以及PD轴的表达，使这些病患成为组织摧毁术和抗PD-1免疫治疗联合治疗的潜在候选者。

 

图1  1级、2级和3级犬软组织肉瘤中PD-1（A）、PD-L1（B）和PD-L2（C）mRNA的相对表达（mean +/- SEM），用Kruskal-Wallis试验评估。每一列代表一个不同的肿瘤级别，每个点代表一个案例。每个靶标和STS病例的数据用18S rRNA表达内部归一化，并显示相对于1级肿瘤的平均归一化表达。

 

 

图2  PD-1（A）、PD-L1（B）和PD-L2（C）mRNA在轻度、中度和显著程度未分化的犬软组织肉瘤中的相对表达（mean +/- SEM）。PD-1和PD-L2在更显著未分化的软组织肉瘤中的表达在数值上更高。无论软组织肉瘤的分化程度如何，PD-L1的表达保持相似。

 

 

图3 组织摧毁术治疗的软组织肉瘤中PD-1（A）、PD-L1（B）和PD-L2（C） mRNA的相对表达（mean +/- SEM），显示了肿瘤治疗界面与未治疗区域组织切片中PD轴基因表达的比较。

 

 

图4 免疫组化分析显微图（40倍放大，Fast Red显色剂与苏木精复染）。上图（a-d）显示病患PD轴高表达和T淋巴细胞浸润多。下图（f -I）显示病患PD轴mRNA低表达，T淋巴细胞浸润少。在图像A、B、F、G中，CD3+细胞显示高亮，在未处理的肿瘤切片中，CD3+阳性细胞的浸润率较高（图A）。同样，在图像C、D、H、I中，Foxp3+细胞显示高亮，在图像C中观察到更多的Foxp3+细胞。

 

 

图5 肿瘤未治疗区域切片中CD3+（A）和Foxp3+（B）细胞数量（mean +/- SEM）与代表治疗界面（“治疗”）的切片中的计数比较。

 

 

图6  CD3+ （A）（p = 0.005, r = 0.78）和Foxp3+ （B）浸润与PD-轴相关基因表达呈正相关。（CD3/PD-1,  = 0.79, p < 0.0001, r = 0.89; CD3/PD-L1,= 0.44, p = 0.006, r = 0.66 and CD3/PD-L2;  = 0.62）. （FoxP3/PD-1, = 0.64, p < 0.01, r = 064; CD3/PD-L1, = 0.30, p = 0.03, r = 0.55 and CD3/PD-L2; = 0.41, p = 0.009, r = 0.64）。为了说明，所示曲线是对数拟合的，而回归分析是对线性值进行的。

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