【兽医肿瘤前沿】53 种犬类癌症的基因组分析揭示了新的突变和较 ...

胡璠

53 种犬类癌症的基因组分析揭示了新的突变和较高的临床可操作潜力

翻译：刘语涵

 

摘要 过去 20 年来，对人类癌症的致癌过程和个体差异性的基因组理解稳步推动了患者治疗结果的改善。学术和商业实验室通常通过临床基因组诊断分析来评估肿瘤组织内的突变，以促进诊断、预后和有效的治疗分层。基因组学的应用揭示了犬类癌症中大量基于突变的生物标志物，这表明彻底改变人类癌症医学的变革原理可以应用于兽医肿瘤学。为了推进犬肿瘤学的临床基因组学和基因组学指导医学，我们开发并验证了犬癌症下一代测序基因组，用于识别临床标本中的多种突变类型。通过这个平台，我们检测了 813 只狗的 828 个肿瘤的基因组图谱，涵盖 53 种癌症类型。我们鉴定了 7856 个突变，包括拷贝数变异、单核苷酸变异、插入缺失和内部串联重复。此外，我们通过纳入来自主要犬类文献综合整理的生物标志物框架以及人类癌症基因组生物标志物文献和临床诊断的推论，评估了这些改变的临床效用。值得注意的是，近90%的病例表现出具有诊断、预后或治疗意义的突变。我们的工作代表了对一个大的犬癌症基因组的全面评估，这是首次全面纳入多种突变类型和生物标志物的结构化注释，展示了在兽医肿瘤学中利用基于突变的生物标志物的临床潜力。

 

关键词 癌症、比较肿瘤学和基因组学、犬、基因诊断、突变型生物标志物

 

1 简介

以基因组学为基础的研究和临床诊断使人类肿瘤学领域发生了革命性的改变。这一进展使得特异性的患者管理达到了前所未有的程度，使得基因组学信息的理解在现代肿瘤医学中不可或缺。通过对单个患者肿瘤进行测序，基于基因组的生物标志物一直被用于指导癌症分类、预后和治疗策略。迄今为止，在150多万例人类癌症病例( COSMIC v98 )的300多种癌症类型中，已经鉴定出738个癌症基因中超过35 000个独特的、可能的致病突变。此外，超过5000个突变型生物标志物被用于人类癌症的诊断、预后和/或治疗指导，其中约 1500 个突变已被纳入 FDA 或 NCCN 指南中。

生成的大量基因组数据是癌症生物学和药物发现等许多领域发现的基础，推进靶向药物的重要里程碑。例子包括用于治疗白血病 BCR-ABL 易位的伊马替尼、用于治疗 BRAF 突变黑色素瘤的维罗非尼以及用于治疗 EGFR 突变肺癌的吉非替尼。这些进展凸显了基因组信息在推动癌症治疗进展方面的重要性。学术中心和商业提供商提供的常规遗传或基因组测试已成为标准肿瘤学检查的一个组成部分。这些测试可以很简单，针对单个基因或突变，例如通过荧光原位杂交诊断白血病中的 BCR-ABL 易位。或者，它们可以是复杂的基于面板的测试，使用下一代测序来同时评估多个基因和生物标志物。典型的例子包括 MSK-IMPACT (www.mskcc.org/msk-impact) 和FoundationOne CDx (www.foundationmedicine.com/test/foundationone-cdx)，两者都是 FDA 批准的人类癌症患者辅助诊断。

总的来说，在真实世界的社区护理环境和大型临床试验中，基因组指导的诊断已被证明是有益的。与没有基因组指导的接受标准治疗的患者相比，由基因组诊断指导的患者管理显示出更长的生存期，更低的治疗费用和更高的生活质量。

越来越多的证据支持基因组学在犬癌症患者临床管理中的实质性实用性。在过去的10年中，犬癌症的基因组学表征和突变型生物标志物发现显著扩大。目前，近150篇同行评审的出版物描述了犬癌症的基因组学研究，涵盖了数以千计的犬癌症基因组。开创性研究集中在狗的各种常见癌症上，包括 B 细胞淋巴瘤、肥大细胞肿瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、神经胶质瘤、口腔黑色素瘤、乳腺癌、移行细胞癌、肺癌等。这些研究揭示了多种癌症中常见的突变，例如 TP53 突变，以及某些犬类品种或肿瘤类型特有的突变，例如 PTPN11 E76K，常见于伯恩山犬的组织细胞肉瘤中。 其中一些突变也存在于来源相似或不同细胞类型的人类癌症中，例如常见于犬乳腺癌和血管肉瘤以及人类乳腺癌中的 PIK3CA H1047R。与人类肿瘤学和狗的新数据类似，识别每位患者癌症的突变在支持诊断、预后和制定个性化治疗计划方面具有巨大潜力，最终改善患者的治疗结果。

开创性研究集中在狗的各种常见癌症上，包括 B 细胞淋巴瘤、肥大细胞肿瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、神经胶质瘤、口腔黑色素瘤、乳腺癌、移行细胞癌、肺癌等。这些研究揭示了多种癌症中常见的突变，例如 TP53 突变，以及某些犬类品种或肿瘤类型特有的突变，例如 PTPN11 E76K，常见于伯尔尼山犬的组织细胞肉瘤中。 其中一些突变也存在于来源相似或不同细胞类型的人类癌症中，例如常见于犬乳腺癌和血管肉瘤以及人类乳腺癌中的 PIK3CA H1047R。与人类肿瘤学和狗的新数据类似，识别每位患者癌症的突变在支持诊断、预后和制定个性化治疗计划方面具有巨大潜力，最终改善患者的治疗结果。

然而，全面的基因组认识仍然仅限于某些常见的犬类癌症。到目前为止，大约2 / 3的已发表的犬癌症基因组研究采用了候选基因的方法，仅基于人类或犬的推论研究一个或几个基因。这种方法在比较肿瘤学环境中提供了有价值的信息，并且还对某些癌症的突变谱（例如黑色素瘤中的 RAS 突变）提供了令人信服的早期观点。 然而，这种方法无法为某些癌症类型提供更广泛的突变图谱，这阻碍了评估突变型生物标志物在研究和临床环境中的潜力。

在本研究中，通过对SearchLight DNATM分析的53种癌症类型的828例犬病例进行回顾性调查，我们确定了突变谱，并评估了在泛癌和特异性肿瘤类型的临床可操作性。该研究揭示了与假定的诊断、预后和预测生物标志物相关的高比例的可操作突变。它引入了首批经过验证的犬癌症基因组之一，并附有详细的生物标志物注释，代表了一种评估多种突变类型的同类首个单平台泛癌症基因组分析，展示了高突变检出率和临床可操作性。

 

2 方法

2.1 样本信息

本研究中包括储存的肿瘤样本。这些样本来自多个来源，包括犬比较肿瘤学和基因组学联盟 (CCOGC)、俄亥俄州立大学 (OSU) 兽医学院生物样本库、诊断参考实验室以及来自科罗拉多州立大学的犬癌细胞系弗林特动物癌症中心和加州大学旧金山分校。样本是根据 IACUC 协议收集的，特别是 2010A0015-R2 (OSU) 和 17 008 (TGen)。此外，该研究还包括 2020 年至 2022 年对客户养的狗进行测序的肿瘤。

肿瘤组织样本在液氮中快速冷冻（FF），福尔马林固定石蜡包埋（FFPE），或在载玻片上抽吸并风干（细针抽吸，FNA）。经美国兽医病理学家学会 (ACVP) 认证的兽医病理学家确认了肿瘤诊断并评估了所有病例的肿瘤含量。随后的基因组分析需要 20% 或更高的肿瘤含量，因为 SearchLight DNATM 已经过优化，可以专门检测具有该纯度水平的肿瘤中的体细胞突变。有关样本的详细信息（包括其人口统计数据）可在表 1（群组信息摘要）和表 S1（样本信息摘要）中找到。

 

2.2 样品处理、测序和生物标志物注释

所有样本均使用 SearchLight DNATM（一种犬癌症 NGS 基因组）进行测序。该面板采用基于杂交捕获的与癌症相关的犬基因富集，通过仅肿瘤测序来检测 SNV、插入缺失、ITD 和 CNV。样品制备、DNA 提取和测序遵循支持信息 S1 中概述的方案。使用定制的仅肿瘤基因组学管道对来自 SearchLight DNATM panel 的序列数据进行分析，该通道在云端完全自动化。有关生物信息学工作流程的详细信息，包括突变检测、过滤和注释，请参阅图 S1 和支持信息 S2。

为了注释每个样本中通过质量过滤器的突变的潜在生物标志物关联，我们通过对来自犬和人的癌症突变生物标志物数据进行系统综述、分析和协调，构建了一个犬精准肿瘤学数据库InsightTM。诊断生物标志物通常被定义为在特定肿瘤类型中富集并怀疑有助于癌症发展的突变，即支持其在癌症中作用的突变模式、频率和/或功能数据。在这里，我们将“诊断生物标志物”更广泛地定义为先前在人类/犬癌症中发现并整理到我们的数据库库中的任何突变。预后生物标志物是与临床结果相关的突变，治疗生物标志物是与对特定疗法的反应相关的突变。采用以人类临床癌症基因组学指南为模型的四级证据级别（A、B、C、D）系统来指示生物标志物关联的置信水平。 在本研究中，我们允许推断跨物种的生物标志物，特别是来自不同物种的生物标志物。这种方法得到了对狗和人类不同肿瘤类型的癌症突变保守性评估的支持。对于主要的犬类生物标志物证据，我们对1991 年至 2022 年基于突变的生物标志物关联的同行评审文献进行了详尽的搜索。使用“canine”或“dog”、加上“cancer”或“neoplasm”以及“genomics”或“mutation”等搜索词来查询 PubMed (pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)、BioRxiv (biorxiv.org) ）和谷歌学术（scholar.google.com）。科学家进行了多轮人工审查，以确定描述基于突变的证据以及与诊断、预后和治疗相关的论文。对于人类证据，我们通过关注具有高证据水平的基于突变的生物标志物、通过序列保守分析和将人类基因/突变翻译成犬类等同物的蛋白质（即“犬化”）来限制推论。

 

3 结果

我们对从 813 只狗身上收集的 828 个犬肿瘤进行了回顾性分析，涵盖 53 种不同的肿瘤类型。在这些肿瘤中，248 个来自储存的组织，580 个来自客户拥有的狗。利用 SearchLight DNATM 癌症面板，我们探索了目标区域内这些肿瘤的基因组图谱，并评估了这些区域中发现的突变的潜在诊断、预后和治疗生物标志物价值（图 1）。

 

图 1 描述肿瘤测序过程、生物信息学突变分析、生物标志物注释和证据代码映射的工作流程。

 

3.1 研究对象的的统计学和肿瘤类型

该列表包括之前基因组特征的肿瘤类型，包括黑色素瘤、骨肉瘤、血管肉瘤和乳腺癌等（表 1，队表信息摘要）。此外，我们还描述了基因组数据相对有限的犬癌症。这些包括肛门囊腺癌（AGASACA）、鳞状细胞癌、神经内分泌癌和唾液腺癌。研究群体由一群犬组成，包括纯种狗和混种狗，年龄从 1 岁到 17 岁不等。在整个列表中，359 只狗是雌性，373 只是雄性，其中 97 只狗的性别信息不详。分析中检查了各种样本类型，包括 FF (n = 160)、FFPE (n = 314)、FNA (n = 174) 和细胞系 (n = 3)。

 

表1 样本列表信息汇总

肿瘤类型	数量	诊断年龄年（范围）	性别（雄性/雌性）	绝育（去势/绝育）	以前使用基因组或候选基因方法进行过研究？
黑色素瘤	103	2-17	50/45【3】	53/41【9】	是
肺癌	87	6-15	28/26【33】	25/24【38】	是
骨肉瘤	80	1-12	38/41【1】	33/41【6】	是
血管肉瘤	74	3-16	26/34【14】	35/23【16】	是
肥大细胞瘤	69	1-17	23/24【22】	18/25【26】	是
淋巴瘤	66	1-15	29/21【16】	28/15【23】	是
未明确肿瘤	47	3-15	21/26	19/26【2】	否
肉瘤	41	2-16	23/18	23/17【1】	是
软组织肉瘤	31	3-14	17/11【3】	15/12【4】	是
组织细胞肉瘤	25	2-14	10/13【3】	13/8【5】	是
肛门囊腺癌	21	5-12	13/8	14/7	否
肝细胞哎	19	.6-13	12/7	9/9【1】	是
脾脏间质肉瘤	18	8-15	9/9	10/8	否
尿路上皮癌	13	7-14	4/6【3】	4/5【4】	是
乳腺癌	12	7-14	4/6【2】	0/7【5】	是
圆形细胞瘤	11	2-12	7/4	3/6【2】	否
神经内分泌癌	10	5-14	6/4	6/4	否
肾癌	10	4-13	8/2	4/5【1】	是
鳞状细胞癌	9	5-13	4/5	6/3	是
癌	8	7-17	3/5	3/5	是
甲状腺癌	7	8-12	2/5	3/4	是
平滑肌肉瘤	6	1-13	1/5	2/4	是
胃肠癌	5	6-11	2/3	5/0	是
鼻癌	5	8-13	3/2	1/4	否
肾母细胞癌	5	.9-4	2/3	2/3	否
胰岛素瘤	4	9-12	3/1	1/3	否
肾上腺皮质癌	3	10-11	2/1	1/0【2】	否
结直肠腺癌	3	6-10	1/2	0/3	是
胃肠道间质瘤	3	11-12	1/2	1/2	是
骨软骨肉瘤	3	4-11	0/3	0/2【1】	否
腺癌	2	3-8	1/1	1/0【1】	否
顶浆腺癌	2	5-11	1/1	2/0	否
胆管癌	2	9-12	2/0	1/1	否
朗格汉斯细胞组织细胞增多症	2	9-12	1/1	1/1	否
间皮瘤	2	7-8	1/1	1/1	否
浆细胞瘤	2	9-12	2/0	1/1	否
唾液腺癌	2	8-10	1/1	2/0	否
软骨肉瘤	1	4	1/0	1/0	是
阴蒂腺癌	1	9	1/0	0/1	否
泪腺腺癌	1	10	1/0	0/1	否
白血病	1	6	0/1	0/1	是
淋巴管肉瘤	1	8	1/0	1/0	否
子宫内膜癌	1	13	0/1	0/1	否
多发性骨髓瘤	1	7	0/1	1/0	否
卵巢癌	1	10	1/0	0/1	是
肛周腺癌	1	7	1/0	0/1	否
基底细胞瘤	1	5	1/0	1/0	否
前列腺癌	1	13	0/1	1/0	是
横纹肌肉瘤	1	1	1/0	0/1	是
精原细胞瘤	1	8	0/1	1/0	否
支持细胞瘤	1	10	0/1	1/0	否
实体瘤	1	8	0/1	0/1	是
胸腺癌	1	4	0/1	0/1	否

 

3.2 不同癌症类型的突变率和基因组图谱

在整个列表中，我们共发现了7856个基因组变异，包括5260个CNVs，2571个SNVs和indels，以及25个ITDs。列表中的CNVs中，log2 fold change值在4.50 ~ + 5.00之间。在SNVs和indels中，变异等位基因频率( VAF )在3 % ~ 99 %之间。在1060个独特的变异中，有266个在人类或犬类癌症中被报道过。无论是在个体内部还是在不同癌症类型之间，基因组改变的累积计数都表现出很大的变异性(图2 )。例如，在黑色素瘤中，这是该列表中最常见的癌症类型（n = 103），我们观察到中位数为 10 个突变（范围：1-34）。对于肥大细胞肿瘤 (n = 69)，扩散更为明显，变化范围为 1 至 104（中位数：6）。此外，显性改变类型的分布也不同，一些癌症受 CNV 的影响更大，而另一些癌症则显示单一 SNV 的患病率更高。在 87 个肺癌肿瘤中，CNV 的数量几乎是 SNV 的三倍（676 比 254）。相反，在五种胃肠癌中，仅观察到 SNV (25)，突出了对比的基因组改变模式（图 S2）。我们绘制了在我们的队列中具有代表性的前 6 种常见犬类癌症（n > 10）中超过 15% 的病例中发生突变的基因。这些癌症包括黑色素瘤、骨肉瘤、肺癌、淋巴瘤、血管肉瘤和肥大细胞瘤（图S3）。在分析的 828 个肿瘤样本中，有 809 个检测到突变。尽管有 19 个病例具有足够的肿瘤纯度并通过了所有质量指标，但 SearchLight DNATM 区域没有显示任何变化。

发现年龄与体细胞突变负荷增加有关，尽管有微弱的( Pearson相关性: R2 = 759 ) = 0.0065，p = .025 )。在该列表中，总体中位诊断年龄为10岁，从最早的6个月到17岁不等。然而，特定的癌症如骨肉瘤和肥大细胞瘤的中位年龄为7岁，而癌症和GIST的中位年龄较高，为12岁，超过了列表的平均水平(图S4 )。值得注意的是，肾母细胞瘤主要在相对年轻的犬( n = 5 ;中位数= 1年)中观察到，这反映了其在人类儿科患者中的流行，通常在2至5年之间诊断。

接下来，我们评估了在该列表中发现的基因组改变可能产生的功能和后果。使用 SIFT 工具注释 SNV 和插入缺失，将超过 57 个独特突变的影响分类为“高”，表明蛋白质结构或功能受到显着破坏，可能导致损伤、过度激活或失调。此外，924 个独特突变的影响被归类为“中等”，表明对蛋白质结构、稳定性或相互作用有中等影响。虽然不存在评估拷贝数改变对个体影响的具体工具，但众所周知，肿瘤抑制基因（TSG）和癌基因（OG）的拷贝数改变可能会影响蛋白质表达和功能，从而破坏正常的细胞过程和功能。导致肿瘤的发生和进展。根据这些观察结果，我们推测，在该队列中发现的 TSG 中 48 个独特的拷贝数丢失实例和 OG 中的 35 个独特的拷贝数增加实例可能会产生有害影响在检测到它们的肿瘤上。

24 个基因的突变影响了 92% 的检查癌症，如图 3 所示。值得注意的是，其中 7 个基因（TP53、CDKN2B、ATM、KMT2D、FANCG、BRCA2 和 ERRFI1）在超过 25% 的研究癌症中表现出改变。就 TP53 和 BRCA2 而言，队列中的 SNV 比 CNV 更为普遍。具体而言，TP53 显示出 63% SNV 对 37% CNV 的比率，而 BRCA2 显示出 69% SNV 对 31% CNV 的比率。相反，CDKN2B 和 ATM 表现出相反的模式，CDKN2B 的 SNV 与 90% CNV 的比率为 10% SNV 与 CNV 的比率，ATM 的比率为 35% SNV 与 65% CNV（图 S5）。

在该列表中前 24 个经常改变的基因中，确定了两个表观遗传修饰因子，即 KMT2D 和 ARID1A，这表明表观遗传失调与犬癌症有关。虽然拷贝数丢失是该群体中普遍存在的基因组改变，但某些基因主要表现出增加。值得注意的是，位于犬基因组 13 号染色体上的 KIT、KDR 和 MYC 基因在肺癌、肥大细胞肿瘤和骨肉瘤等肿瘤中表现出几乎独有的优势。此外，该研究还发现了多个基因在同一肿瘤样本中表现出同时突变的趋势（表 S2，基因的共现）。例如，在 195 个样本中观察到 TP53 和 ATM 突变同时出现，涵盖多种癌症类型，如肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤和肥大细胞瘤（Fisher 精确检验：p < .001）。同样，TP53 和 CDKN2B 在 154 种肿瘤中同时出现，其中 38 例肺癌和 31 例骨肉瘤中患病率较高（Fisher 精确检验：p < .001）。这些基因之间的非随机关联表明潜在的功能或生物相互作用会影响它们所流行的癌症的发展。

某些基因的改变，如BRAF和CDK4，在队列中呈散在突变，但在特定类型的癌症(如图2所示)中显示出更高的发生率。此外，在我们的队列中，在1 %的所有癌症中发现了罕见的PTPN11突变(图2 )，显示出对组织细胞肉瘤( HS )的显著偏倚，在大约32 %的HS病例( Fisher精确检验: p < . 05)中观察到。另一个引人注目的例子是TRAF3，它是我们的队列( 51 % , Fisher精确检验: p < .05 ;图2)中淋巴瘤中最频繁突变的基因，以前与疾病有关。这些基因的过度表达表明在特定癌症的发展和进展中可能起驱动作用，并可能指示细胞起源，特别是癌症的组织学。

 

图 2 特定癌症中的肿瘤突变计数和基因富集。

 

3.3 可操作性范围：基因组生物标志物及其特征

正如方法中所述，该列表的生物标志物注释来自各种来源，包括来自人类和犬类研究以及人类肿瘤学数据库的同行评审出版物。总的来说，该列表由 87 个基因的 5587 个改变组成，这些改变表现出潜在的诊断生物标志物关联（图 4A）。在我们的目标背景下，这些关联表明这些改变已被证明在某些肿瘤类型中存在或富集，无论是在犬科动物还是人类中。在 5587 个改变中，1738 个显示出预后效用，而 1873 个显示出治疗关联，如图 4A 和表 S3（每种癌症的生物标志物统计数据）所示。大约 10% 的突变表现出所有三种类型的关联（诊断、预后和治疗），而 26% 的突变表现出两种类型的关联。

在 87 个基因中发现的生物标志物（图 4B）被映射到证据级别 A、B、C 或 D，以表明其关联的置信度。例如，TP53 失活突变，包括拷贝数丢失 (CNL) 和功能丧失突变，是该队列中最常见的预后生物标志物，分别有 185 例和 100 例。这些生物标志物被广泛认为是各种人类癌症的阴性预后指标，并得到共识指南 (nccn.org/guidelines) 的推荐。 因此，它们的证据级别为 A。治疗性生物标志物的证据级别为 A 至 D （图S6）。同源重组修复 (HRR) 基因（如 ATM、BRCA1/2 和 CHEK2）的失活突变已证明对奥拉帕尼等 PARP 抑制剂具有显着的预测价值。这些突变已获得 FDA 批准用于治疗卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌，以及 HRR 基因中存在有害突变的前列腺癌。 因此，ATM CNL 和 CHEK2 CNL 被归类为“A 级”治疗生物标志物，并且属于“A 级”治疗生物标志物。该列表中最常见的治疗生物标志物，分别出现在 175 例和 123 例病例中。另一方面，在临床前细胞系研究中，特定的 TP53 突变（例如 p.R226H）与曲美替尼耐药相关37，并被归类为“D 级”。在该队列中，有 762 例具有 A 级治疗生物标志物，359 例具有 B 级治疗生物标志物，752 例具有 C 级和 D 级生物标志物。

在列表中，在个体癌症水平上，大多数癌症类型都表现出所有三种类型生物标志物的显着存在，如图 4C 所示。例如，在我们队列中的 80 名骨肉瘤患者中，其中 91%、84% 和 91% 的人分别携带与诊断、预后和治疗生物标志物相关的突变。这种生物标志物高效用的趋势在包括 AGASACA 在内的多种癌症中持续存在，其患病率在每个类别中分别为 67%、48% 和 62%，尽管低于上述值。

 

 

图3 Oncoprint展示了顶端基因的分布、变异类型、年龄和癌症诊断。

 

图 4 列表中发现的潜在基于突变的生物标志物关联的总结。 (A) 欧拉图显示队列中存在的诊断、预后和治疗生物标志物的原始计数。在我们的研究中，诊断生物标志物被定义为以前在人类/犬类癌症中发现并已纳入我们的知识库的任何突变。 (B) 总共 87 个基因发生了与至少一类生物标志物相关的改变。 (C) 条形图显示了选定癌症的按类型分类的生物标志物的频率。

 

3.4 比较基因组学揭示了犬和人类癌症之间的保守突变和共有的假定生物标志物

在人类癌症中，某些基因组位点更容易发生反复突变。这些突变被称为“热点”突变，其发生频率比预期的偶然更高，并且通常与特定的癌症类型或亚型相关。 通过提升或犬化过程，我们在我们的列表中发现了 338 个突变（其中 165 个是独特的）对应于人类癌症中的热点突变，包括 BRAF V588E（人类：BRAF V600E）和 KRAS G106V（人类：KRAS G12V；这种突变在狗中也更常被称为 KRAS G12V。G106V 是根据最长的 KRAS 转录本 ENSCAFT00000093055 注释的.1，选择用作 Ensembl CanFam 3.1，版本 99)、EGFR L792R（人类：EGFR L858R）和 PIK3CA H1047 的整个通道的标准转录本。除了共同的热点突变外，我们还观察到612个突变( 324个独特的)，这些突变在人类、犬和其他物种中是保守的，由GERP + +注释确定。39个突变中，95 %已经根据FATHMM40或SIFT.41的计算机预测在COSMIC中被注释为致病性突变。

除了在泛癌症环境中鉴定犬和人类癌症中共享的热点和保守突变外，我们还观察到两个物种之间在组织学上相似的肿瘤中存在共同的基因和突变。当将我们队列中观察到的改变数据与COSMIC数据库中47种与狗肿瘤类型相当的人类肿瘤类型的体细胞改变进行比较时，我们发现在这些相同的癌症中总共存在56个SNVs和indels。此外，我们注意到相应疾病中 291 个 CNV 的可比倍数变化（评估为基因 + CNV 类型）（表 S4，同等犬类和人类癌症中的直系同源突变）。这些直系同源变化的例子包括影响淋巴瘤中 FBXW7 的功能丧失突变（在我们的队列中发现了 3 例）、黑色素瘤中 CDK4 的拷贝数增加（28 例）和肝细胞癌中的 CTNNB1 D32X 突变（3 例）。

 

4 讨论

4.1 增强对常见和罕见肿瘤的犬癌症基因组见解

对犬癌症的基因组学分析越来越多地发现了突变与癌症表型之间的新关联，揭示了新的生物学假设，并确定了具有潜在临床应用价值的生物标志物。然而，许多犬类癌症缺乏全面的基因组特征，这仍然阻碍了在人类肿瘤学中已证明有益的临床基因组指导的有效实施。

犬癌症的基因组分析越来越多地发现突变与癌症表型之间的新关联，揭示新的生物学假设并确定具有潜在临床应用的生物标志物。然而，许多犬类癌症缺乏全面的基因组特征，继续阻碍临床基因组指导的有效实施，而临床基因组指导已被证明对人类肿瘤学有益。为了解决这一差距，我们利用了专为犬类癌症设计的基因测序面板。我们的研究验证了先前研究的癌症（如乳腺癌和血管肉瘤）的突变谱，同时还建立了全面的基因组谱并发现了先前研究不足的癌症（如肝细胞癌和鳞状细胞癌）的潜在驱动突变，CNV、SNV、插入缺失和 ITD 是众所周知的驱动癌症发展的关键突变类型。在我们的列表中，CNV 被发现是最普遍的遗传改变，某些癌症（例如骨肉瘤）的 CNV 比例显着较高，而其他癌症（例如 GIST）则在 SNV 中占主导地位。这表明不同的癌症是由独特的机制驱动的，同时测量这些关键突变类型至关重要，以便获得单个肿瘤内和不同癌症类型之间的全面突变谱。

然而，在一些癌症中，例如 AGASACA，尽管具有足够的肿瘤含量并且得到了病理学家的确诊，但我们观察到突变和可操作性方面的产量较低。这可能是由于样本量有限或驱动突变超出了小组的范围，并且可能需要使用全外显子组或全基因组测序进行进一步研究。总体而言，我们的研究结果确定了致病性突变，有助于了解许多犬类癌症的基因组图谱，并有助于指导对分子亚型、患者分层和靶向治疗开发的进一步研究。

 

4.2 基因组分析和跨物种推论揭示了假定的生物标志物关联

基于突变的诊断生物标志物有可能增强分子表征和诊断，当与临床病史和病理学和免疫组织化学等一系列其他诊断工具结合使用时，可以改善干预患者结果。在某些情况下，它们还可能有助于解决特定临床问题下的一组特定差异之间的诊断困境，例如，当其他测试模棱两可时，支持特定的圆细胞肿瘤类型。 然而，重要的是要注意当考虑所有可能的肿瘤类型时，即使在人类癌症中，只有有限数量的突变被认为对于特定肿瘤类型具有完全特异性（明确诊断性）。在我们的队列中，我们观察到特定癌症的变化显着丰富，这为了解与其相关的肿瘤的分子特征和起源提供了宝贵的见解。 CTNNB1 和 PTPN11 等基因的反复突变虽然并非普遍存在于所有肿瘤中，但在某些癌症类型（如肝细胞癌和组织细胞肉瘤）中分别表现出特定的富集。这些观察结果以及病理学结果和其他临床数据可以作为各自疾病的潜在诊断辅助手段。它还强调了基因组改变的临床意义，并强调了它们在未来癌症诊断中的有希望的作用。

此外，利用犬化原理，作者对序列保守性进行了全面分析，并将人类癌症突变转化为犬基因组，可以利用信息丰富的领域对基于突变的生物标志物数据得出合理的推论。人类肿瘤学。在多个物种中发现的直系同源突变也可以作为潜在的预后生物标志物。例如，已知 TP53 功能丧失突变和 PTEN 拷贝数丢失与各种人类癌症的不良预后相关，与预后的负相关也在犬骨肉瘤和肥大细胞肿瘤中得到重现。 我们列表中的 110 名泛癌患者，他们所携带的 TP53 功能丧失突变可能预示着他们的不良结果。同样，利用比较基因组数据来识别引起疾病的基因改变和定制疗法，在推进个性化治疗、改善患者治疗效果以及证明从人类基因组研究中获得的知识与犬类癌症的相关性和跨物种适用性方面发挥着至关重要的作用。例如，BRAF V600E（犬：BRAF V588E）热点突变已证明与人类癌症中对 RAF 和 MEK 抑制剂的治疗敏感性密切相关。 此外，临床前研究和临床试验为选择性 BRAF 和 MEK 抑制剂的疗效提供了令人信服的早期证据。 MEK 抑制剂治疗携带 BRAF 突变的犬类。因此，通过利用从人类患者获得的见解并在犬身上进行原理验证研究，探索携带 BRAF 突变的犬类患者的治疗策略成为一项可行且有前途的努力。

识别癌症数据中同时发生的突变是另一个概念，对精准医学和癌症患者管理的临床指导具有重大意义。这些突变为诊断、预后和潜在的治疗反应提供了宝贵的见解。此外，探索共存基因之间的相互作用可以指导针对多个基因或途径的联合疗法的开发。例如，众所周知，人类前列腺癌中 ATM-PTEN 突变的频繁共存对预后、治疗策略和临床结果具有重大影响，这可能适用于我们队列中表现出相同特征的 74 个肿瘤。同时发生。同样，结直肠癌中同时存在的 APC 和 TP53 基因突变可作为诊断特征。 APC 基因调节细胞生长，而 TP53 则充当肿瘤抑制基因。因此，两个基因的同时改变可能表明该疾病更具侵袭性，需要更强化的治疗方法。通过将这些发现转化并应用于犬科动物中同等的同时发生的突变，我们可以产生新的假设，促进分子分类和潜在可药物靶标的识别。

 

4.3 总结

这项工作展示了我们定制的 SearchLight DNATM 癌症面板的实际应用，以验证众所周知的犬癌症的突变谱，并为先前研究不足的恶性肿瘤建立全面的基因组谱。通过这项努力，我们成功地鉴定了候选致病突变，增强了我们对这些疾病的理解，并促进了开发新治疗方法所需的分层。我们的研究还揭示了我们的小组在不同癌症类型中的临床效用，并通过基于突变的生物标志物与临床管理的诊断、预后和治疗策略之间的假定相关性得到证实。

我们未来的计划包括深入研究以各种方式扩展我们的知识库。除了对癌症组中 120 个癌症基因内的 SNV、插入缺失、ITD 和 CNV 进行分析（这是本研究的重点）之外，我们还计划扩展到其他类型的基因组改变，例如已发挥作用的易位和融合。在特定癌症类型中发挥重要作用。值得注意的例子包括先前在犬慢性单核细胞白血病中观察到的 BCR-ABL 融合 49 和犬弥漫性大 B 细胞淋巴瘤中的 IGK/CCND3 重排。我们还计划增加所研究的各种肿瘤类型的队列规模，这将为我们提供帮助。具有强大的统计能力，可以全面评估突变负荷并在基因、突变和通路水平上识别肿瘤类型特异性富集。

对于我们不断加深对犬癌症中这些不同改变的作用的理解，至关重要的是补充人类推理、计算机预测和现有的主要犬文献，并进行大量工作来评估这些突变对犬组织和肿瘤的影响。这将包括严格的功能评估和强有力的前瞻性研究，最终为增强对犬癌症的理解和改善管理铺平道路。尽管如此，我们今天在这里获得的全面数据清楚地强调了基因组评估和基因组诊断的直接价值和潜力，不仅可以指导假设生成和新的临床转化发现，而且可以指导当今犬癌症患者的临床管理。

我们预计，我们当前和未来的研究结果将丰富临床医生有效管理犬类癌症的能力，并推动未来的研究，最终将改善犬类癌症患者的治疗结果和更好的生活。

杨先生

南海

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