【兽医肿瘤前沿】四肢骨肉瘤患犬循环肿瘤细胞随时间推移的定量测 ...

胡璠

四肢骨肉瘤患犬循环肿瘤细胞随时间推移的定量测定

翻译：徐晋

 

摘要

循环肿瘤细胞（CTC）计数在人类癌症的预后判断和治疗决策指导方面显示出良好的前景。本研究的目的是在患有自然发生的骨肉瘤（OSA）的犬中，随着时间的推移计数CTC，并确定与病患预后的相关性。26只患有OSA并且在截肢时没有转移性疾病证据的犬被纳入研究。在截肢前和截肢后，以及每次来院化疗时，对犬的肺转移和CTC进行评估。21只犬完成了这项研究。19只犬被安乐死，2只存活并且没有转移。总生存时间为88-1058天，中位生存时间为374天。血清碱性磷酸酶活性升高、高龄和体重增加与较低的MST显著相关。OSA患犬平均有356（0-4443）个CTC/106个白细胞。在15只犬中有12只出现了放射学证据的转移，在转移前平均36.5天（1-100天）可检测到转移前的CTC峰值，并且与显著较短的MST相关（301±64天对626±55天；P = 0.0107）。在一项多变量分析中，有CTC峰值的犬比没有CTC峰值的犬死亡的可能性高10倍。这些结果表明，在OSA患犬中，CTC数量的激增先于发现转移，并且与较短的生存期相关。可能需要对更大的OSA患犬队列进行更频繁地CTC计数。

 

1 简介

在截肢或保肢的肿瘤切除和化疗后，四肢骨肉瘤（OSA）患犬的中位生存时间（MST）为235-540天，但从2-30个月不等，这表明肿瘤生物学和/或宿主因素存在广泛的异质性。虽然只有10%的病患在诊断时有转移的影像学证据，但90%的病患在截肢后1年内死于转移性疾病。肺转移的高概率意味着在诊断时可能存在微转移，经血液而非经淋巴转移更常见，原发肿瘤、微转移和宿主之间复杂的相互作用影响了显性转移的发生。

由于影像学的敏感性和特异性有限，微观的肿瘤播散的检测非常困难。胸片是诊断肿瘤肺转移的标准检查方法，但其检出受多种内在因素的影响。此外，由于典型的无骨化，肺转移瘤在直径为7-20 mm时才能被可靠地识别。计算机断层扫描（CT）在检测肺小结节方面较好，但在识别微转移性OSA方面也缺乏敏感性。

循环肿瘤细胞（CTC）是从肿瘤中释放出来的，包括具有形成远端转移潜能的细胞。转移瘤的形成包括细胞与原发肿瘤的黏附性丧失、进入血管、在静脉循环中迁移、在特定的毛细血管部位停滞、外渗、侵犯实质组织和建立转移瘤。这些步骤中的每一个都受到宿主、肿瘤和微环境因素的影响。CTC的生物学特性高度可变，只有一小部分CTC有活力并能够形成转移。

循环肿瘤细胞计数已被用于预测人类癌症患者的预后、监测疾病进展和调整治疗。一种CTC计数方法（CELLSEARCH）可预测总生存期和无进展生存期，并被认为是在转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌患者中计数上皮CTC的金标准。该检测包括表达上皮细胞黏附分子（EpCAM）的细胞的免疫磁富集和随后的计数，并被认为对患有转移性乳腺癌的犬也有用。然而，该方法不适用于OSA等间质性肿瘤，在这些肿瘤中，尚未发现一致表达的细胞表面标志物。使用该技术在乳腺癌或前列腺癌患者中检测到的CTC数量通常是10个CTC/7.5 mL血液，显著的预后差异可归结于检测3个与5个CTC/7.5 mL血液。通过白细胞去除、免疫化学和荧光原位杂交等方法对OSA CTC进行的计数同样表明，与2个CTC/7.5 mL血液相比，≤2个CTC/7.5 mL血液与OSA病患的无进展生存期显著不同相关。血液中骨特异性mRNA的增加也与随后12个月内发生转移显著相关。最近，Dai等人报道了MP3阳性CTC计数在辅助诊断OSA转移方面的最佳性能，并且每5 mL外周血中≥4个IMP3阳性CTC是转移的预测因素。很少有研究对兽医病患的CTC计数进行调查。据作者所知，没有兽医研究在自然发生的OSA患犬身上观察CTC。

在这项研究中，我们开发了一种流式细胞术检测CTC的方法，并在一组OSA患犬中进行验证。初步研究结果表明，与无OSA犬相比，CTC在四肢骨肉瘤患犬中很常见，犬的CTC数量比人类癌症患者的CTC更多，CTC的增加预示着疾病的进展。本研究的目的是在一组接受截肢和化疗的四肢骨肉瘤患犬中，前瞻性地计数OSA的CTC，并研究CTC与转移发生和预后的相关性。我们假设，OSA患犬CTC数量的增加可以预测即将发生的显性转移。

 

2 研究方法

2.1 病患

20公斤以上疑似或确诊为四肢骨肉瘤且无明显转移的犬预期被纳入研究。研究方案得到了圭尔夫大学动物保护委员会的批准（#3571协定）。犬只在主人知情同意的情况下被纳入研究。对参与研究者不提供任何补偿，并且允许在任何时候根据主人和/或初级临床医生的意见退出。

 

2.2 临床处置

所有犬通过对患肢截肢对原发性OSA进行确切治疗。OSA的诊断是基于截除的肢体的组织病理学检查。记录肿瘤类型和分级。

根据机构方案，在截肢后10-14日开始标准化疗。所有犬接受卡铂（辉瑞，柯克兰，PQ）300 mg/m2单药静脉给药，21天为1个周期，共4个周期。首次给药后，根据肿瘤科医生的偏好，每7日或14日进行一次CBC检查。在下一次卡铂给药前，每次就诊时对犬进行全血细胞计数和血清肌酐或全项生化检查。若中性粒细胞计数 <2 ×109 /L，血小板计数<75×109 /L，或观察到不良临床事件，化疗延迟和/或减量。5只犬在完成卡铂治疗后接受雷帕霉素（雷帕霉素，0.1 mg/kg，辉瑞）治疗。

CTC计数采用颈静脉或侧隐静脉穿刺、2.0 mL采集管采集1-2 mL血（EDTA；BD，富兰克林湖区，新泽西州）。所有血样保存在4℃，24 h内分析。我们在术前采集了血液样本，然后按照主治肿瘤医生的预约时间进行复检。因此，在临床上可能的情况下，我们在截肢前即刻（时间点A）、截肢后24小时内（时间点B）以及在4个化疗周期中，从截肢后2周开始（每3周1次，时间点C-F）测定CTC。之后每2-3个月采集一次样本，以及在根据胸片重新分期时（时间点G及以后）采集，直至发现转移、其他原因死亡或研究结束。

 

2.3 转移的检测及转归

在截肢前进行三体位胸片检查，主要是在第3或第4剂化疗时，之后每2-3个月进行一次。在主治临床医生认为必要时进行了其他诊断性检查。射线照片由委员会认证的放射科医生解读。发现转移灶后，停止CTC计数。

病患的转归通过与主人和转诊兽医的复查和/或电话随访确定。记录首次发现转移的时间、转移部位、死亡或安乐死时间、剖检结果、死亡或安乐死原因。无病间期（Disease free interval, DFI）定义为从截肢到发现转移的时间。生存时间（Survival time, ST）定义为从截肢到死亡或安乐死的时间。长期存活的犬（在研究结束时存活，且ST＞1000天）和死于其他原因的犬被剔除。肿瘤体积如述根据截肢后肿瘤测量值计算。

 

2.4 CTC计数

CTC计数如前所述。（见补充材料）结果表示为CTC/106个白细胞。“CTC峰值”的定义为第一次化疗后的CTC数量最高（时间点C）。“转移前峰值”的定义为转移前100日内的CTC增加。通过胸片和/或剖检确定转移。

2.5 统计分析

使用PROC MEANS计算连续变量的总结。使用PROC LIFETEST对单个分类变量（性别、峰值、肿瘤位置、CTC峰值、转移）进行生存时间分析，以检验差异（Log-Rank检验），并提供四分位数估计值及其95%置信区间(CI)。当连续变量（年龄、体重、CTC数量、ALP、临床症状持续时间、肿瘤体积、生存时间）或多个变量被检测时，采用PROC PHREG应用Cox比例模型进行效应检验，估计风险比和确定CI。使用PROC CORR计算连续变量之间的Spearman's rho，使用Mann-Whitney检验比较犬的平均年龄和体重变量。使用PROC单变量进行Wilcoxon符号秩检验，比较转移时和转移前峰值的CTC。此外，使用PROC确定转移时和峰值时的CTC四分位数。为了比较犬的平均CTC，以及存活和死亡之间的CTC，使用PROC NPAR1WAY进行了Mann-Whitney检验；一个是A, B, C，第二个是A-f。PROC FREQ检验用Fisher精确检验确定6个月的生存率是否与肿瘤位置相关。在有或没有转移前峰值的犬之间比较CTC，采用单因素方差分析使用PROC单变量。对数据进行对数转换以满足正态性标准。我们还使用PROC获得了所有犬的CTC四分位数，以及那些有OSA和转移前峰值的犬的CTC。P＜0.05为差异显著。

 

3 结果

3.1 病患

2016年5月至2017年11月，共纳入26只四肢骨肉瘤患犬。研究观察期于2019年8月1日结束，共1184天。4只犬因CTC计数时间点不足（未采集血样、样本制备错误、细胞仪故障或主人拒绝静脉穿刺）被剔除，1只犬失访。

21只犬完成了这项研究。（表1）初始体重的平均值和中位数分别为35.43±9.67和35.6 kg。平均年龄8.18±1.82岁，中位年龄7.96岁。OSA原发病灶位于桡骨远端（n = 9；43%）、胫骨远端（n = 4；19%）、肱骨近端（n = 3；14%）、股骨远端（n = 2；10%）；尺骨近端（5%）、胫骨近端（5%）和肩胛骨（5%）各1例。16只犬的肿瘤体积为0.131-1734.16 cm 3，平均和中位数分别为163.39和27.49 cm 3（表2）。

 

3.2 临床处理

所有犬术前均进行了全血细胞计数和生化检查，13只犬进行了尿液分析。血清碱性磷酸酶（ALP）活性平均值为141.57 U/L，中位数为52 U/L（范围：17-1524 U/L；参考范围[RI] 22-143 U/L）。术前2只犬激素诱导的碱性磷酸酶（sALP）活性轻度升高，1只犬sALP活性明显升高（1524 U/L, RI 0-84 U/L）。所有病患均无肺转移的影像学证据，17只犬的腹部超声检查均无转移的证据。病患截肢前临床症状持续时间4-82 d，平均39 d，中位35 d。最初的异常表现为19只犬（91%）间歇性至持续性中度跛行，1只犬（5%）因病理性骨折导致重度急性跛行，1只犬（5%）出现骨肿块（表1）。

所有犬术前均未接受化疗。在21例手术中，19例由经过委员会认证的外科医生或住院医生实施，2例在转诊前由初级保健兽医实施。手术包括14只犬（67%）的前肢截肢，6只犬（29%）的髋股关节切断，1只犬（5%）的股骨近端截肢以局部控制胫骨远端肿瘤。所有肿瘤经组织病理学证实为OSA。12只犬的肿瘤分级分别为1级 （3；25%）、2 级（4；33%）和3级（5；42%）。

术后所有犬开始卡铂化疗，17只（81%）完成治疗。4只犬因发生肺转移（n = 3）或腹腔出血伴弥漫性腹腔内转移（n = 1）而未完成化疗。

在研究结束时，19只犬（90%）因临床恶化而被安乐死，2只犬（10%）存活并在第1047天和第1062天未发现转移。19只犬中有15只（79%）因OSA转移而安乐死。7只犬（47%）通过胸片确定了转移部位，1只犬（6.5%）通过胸片和剖检确定了转移部位（肺），4只犬（26.5%）通过胸片和剖检确定了转移部位（肺和其他器官），3只犬（20%）通过剖检确定了转移部位（仅骨转移）。

19只犬中有4只（21%）因脾血管肉瘤、十字韧带断裂、颈部神经病变或软组织肉瘤而安乐死。其中3只犬接受了剖检，证实没有转移性OSA。

 

3.3 CTC频率

共分析了184份血样，每只犬的平均和中位数分别为8.8（4-21）和7.0。（表3）6只犬在截肢前（时间点A）、1只犬在截肢后24小时内（时间点B）以及8只犬在A和B时采集样本。（图2）所有的犬在第一次化疗前立即取样，之后依次取样，直到转移或研究结束。

184个血液样本中有166个被鉴定出循环肿瘤细胞，每只犬至少有一个样本被鉴定出循环肿瘤细胞。平均和中位CTCs分别为356（0-4443）和177个细胞/106个白细胞。15只发生转移的犬中有12只在放射学证据显示转移前100天内有CTC峰值（第一次化疗剂量后的最高CTC数量）（=转移前峰值）。在这些犬中，在整个研究过程中，平均和中位CTC分别为457（±751）和185个细胞/106个白细胞（范围：0-4443个细胞/106个白细胞）。3只没有转移前CTC峰值的犬也发生了转移。2只犬在研究期间既没有出现转移前的峰值，也没有发生转移，存活＞1000天，被认为是长期幸存者。4只没有发生转移或转移前峰值的犬因与OSA无关的原因被安乐死。（表3）9只没有转移前峰值的犬的平均和中位CTC分别为284（±392）和176个细胞/106个白细胞，这与有转移前峰值的犬没有显著差异（p = 0.904）。

12只犬的平均和中位CTC在转移前峰值时分别为1932和2110个细胞/106个白细胞，在转移时分别为346和143个细胞/106个白细胞。转移前峰值时的平均CTC显著高于转移时的CTC （p =0 .0156）。我们无法根据细胞数量或增加百分比确定可预测即将发生转移的CTC临界值。

 

3.4 存活

总体中位DFI为165天 （95% CI: 91天，322 天）。有CTC峰值的12只犬的中位DFI为104.5（95% CI: 88，322天），而没有CTC峰值的9只犬中3只的DFI为589（范围：265，687）（p =0 .246）。其余6只犬由于与OSA无关的原因被实施安乐死，或在研究结束时仍存活，这些犬没有出现CTC峰值，因此没有获得DFI。21只犬的总生存期为88-1058天，平均生存期为374天（242天，687 天）。21只OSA犬的1、2和2.5年生存率分别为52% （n = 11）、24% （n = 5）和14%（n = 3）。2例长期存活动物在审查时仍存活（分别为1042天和1058天）。（表2）12只有转移前CTC峰值的犬的MST为280.5（105,383），而9只没有CTC峰值的犬的MST无法计算（下限：264），因为这些动物中只有3只死于OSA（6只被剔除）。检测CTC峰值与ST降低显著相关（p =0 .006）。在多变量分析中，有CTC峰值的犬死亡的可能性是没有CTC峰值的犬的10.76倍。

在单变量模型中，年龄（p = 0.0800）和体重（p =0 .295）与存活率没有显著相关性。与所有其他部位相比，存活6个月的犬桡骨远端更易发生OSA（p =0 .0046）。在多变量模型中，检测CTC峰值（p = 0.0004）、体重（p = 0.0274）和年龄（p = 0.0478）与生存显著相关。年龄每增加1岁，死亡概率增加约1.4倍，体重每增加1 kg，死亡概率增加约1.07倍。

诊断时sALP升高与生存率降低显著相关（p = 0.0065）。sALP升高的犬的死亡概率是sALP正常犬的7.5倍（OR 7.513；置信区间1.51-31.25）。肿瘤体积与生存时间（p = 0.823）、肿瘤体积与诊断前临床症状持续时间（p = 0.519）、诊断前临床症状持续时间与生存时间（p = 0.713）均无显著相关性。肿瘤体积与截肢前（p = 0.194）或第一次化疗前（p = 0.509）的CTC无显著相关性。

 

4 讨论

OSA犬的生存情况的准确预测指标仍不明确。在这项首次开展的研究中，我们在接受截肢的自然发生的四肢骨肉瘤患犬的整个化疗期间计数了CTC，直至检测到转移。我们的研究结果提示，检测到CTC升高与较短的生存期相关。然而，由于无法确定预示即将发生转移的临界值，因此目前只得认为该技术在临床上不切实际。

目前提出的CTC相对于基于影像的分期的主要益处是能够通过“实时液体活检”识别转移前的细胞，并且能够从诊断时和整个治疗期间跟踪疾病负担。在人类癌症患者中，与影像学检查相比，CTC计数是疾病状态的一个更及时、更有代表性的指标，并且与生存期的相关性更好。对于人类，当代的CTC计数是通过标准化的商业检测法（如CELLSEARCH）进行。类似的检测方法不能用于兽医。在本研究中，通过使用相同的采血管和体积、一致的细胞制备、一致的流式细胞仪设置和分析方法以及对大量活细胞的分析，最大限度地采用了之前验证过的检测方法。

与报告的人类CTC相比，OSA患犬的CTC频率较高，但在高转移性癌症患者中，每7.5 mL血液中有23 618个CTC，并且与本文中发现的数字相似。Wu等发现，OSA患者的CTC高于大多数癌症的典型CTC。因此，患有OSA的人和犬中频繁出现的CTC可能反映了这种肿瘤的侵袭性和高转移可能性。犬OSA具有极高的转移潜能，通常在疾病相对晚期才被诊断出来，并且具有显著的生物学异质性，这使得在诊断前估计疾病的持续时间具有挑战性。

虽然我们分析了每例参与者的多个样本，但队列的规模有限，无法确定表明即将发生转移的确切临界值。然而，在大多数随后发生转移的犬中，转移前的CTC激增，以及这一激增与较短的ST之间的强关联，提供了令人信服的证据，表明CTC频率的增加反映了OSA患犬的肿瘤进展。纳入现实生活病患的临床试验很少不会偏离预定的治疗和评估，而且更严格的时间安排可能可以更好地确定CTC频率与转移检出之间的关联，但这是不可能的。

在所有犬中，尽管通过截肢和随后的化疗推测原发肿瘤被完全切除，但CTC仍持续存在。在结直肠癌患者中，手术切除后24小时内CTC减少表明预后良好，而RT-PCR检测到的CTC持续存在是复发的强预测因素。在OSA患犬中，截肢后不久检测到的CTC很可能表明当时存在以其他方式检测不到的微转移。由于在发现或切除原发肿瘤之前，肿瘤细胞可能会扩散数月至数年，因此这种暂时性分离可能是意料之中的。当CTC从血管系统迁移到组织储存部位（如骨髓和其他部位）时，播散性肿瘤细胞（DTC）就产生了。这些DTC可以停止增殖，并在很长一段时间内过渡到静止状态，即休眠。在肿瘤细胞休眠期间，既不能检测到转移灶，也不能检测到CTC。原发肿瘤切除后，DTC可脱离休眠状态，重新进入循环形成转移灶。这里观察到的转移前峰值可能代表DTC重新活化并作为CTC从储存部位释放，然后沉淀转移肿瘤的形成。虽然DTC再激活的机制尚不完全清楚，但有人提出，切除原发肿瘤可能降低某些病患的肿瘤负荷并提高生存率，但会刺激和加速另一些病患的转移。虽然难以证明，但手术切除原发肿瘤可能是OSA犬释放DTC的一个触发因素。

由于不同病患的疾病进展和生存期不同，并且早期时间点的样本不完整，因此很难比较不同病患的CTC频率的时间模式。在大多数OSA患犬中，CTC频率在就诊C（化疗开始）时下降到可忽略的水平，并一直保持低水平，直到转移前的峰值。对于贡献了多个低CTC数量的样本的长期生存者，这一点尤其明显。在这些犬中，术后期间的CTC数量通常极低，可能持续数月至数年。

虽然OSA的体积可以预测人类的转移性疾病和ST，但在本研究中，肿瘤体积和临床疾病持续时间均与ST无关。在本研究中，肿瘤体积、肿瘤位置和确诊前的病程也与CTC无显著相关性。这可能反映了有限的样本量，二维X线片测量的肿瘤体积不准确，犬OSA的生物学异质性，或者与人类相比，犬的诊断相对较晚。病患评估和采血的频率反映了我们医院的医疗标准和业主的偏好。在一些犬中，CTC峰值与放射学检测到的转移相吻合，这可能表明了采样计划未捕捉到的CTC快速增加或肿瘤快速发展。相反，在其他犬中，CTC峰值和检测到转移之间的滞后可能意味着交替或强化治疗的机会窗口，如果这个峰值可以被识别为即将发生转移的迹象。

流式细胞术鉴定CTC有局限性，尤其是与更广泛优化的技术（如CELLSEARCH）相比。为了在混合白细胞（可能还包括少量的内皮细胞、纤维细胞、巨噬细胞等细胞）中重复计数罕见的CTC（＜0.001%），需要采集＞106个总细胞的光散射和荧光特性。在人类中，伤口和骨折修复以及纤维增殖性疾病与循环中COL I-阳性细胞相关，在本研究中，犬也可能发生这种情况。因此，如应用于人类肿瘤，通过初始富集循环中的非白细胞进一步改进技术可能是值得开发的。CTC频率也可能被低估。高级别肉瘤可能发生间质细胞向上皮细胞转化或达到以胶原生成减少为特征的中间（“亚转移”）表型。这种转化的CTC在本文使用的检测方法中检出的可能性较小。

这项研究中关于OSA患犬的一些发现强化了先前的断言：这种疾病主要影响中老年，大型犬，ST和DFI通常＜1年，血清ALP活性增加，年龄和体重与较差的结果相关。肿瘤位于桡骨远端的预后也优于所有其他部位的预后。

本研究的局限性和优势是临床研究固有的。在纳入研究时，疾病分期和亚型存在差异，在某些情况下，主人的担忧优先于在预先确定的时间间隔内的样本采集和影像学检查，并且并非所有死亡病患都接受了剖检。然而，这项研究反映了犬OSA的多样性和临床病例研究的典型情况。OSA患犬中CTC的高频率，以及CTC峰值与MST降低的显著关联表明，CTC计数可能发展为有价值的预后检测，但这需要进一步完善和研究。

 

 

 

图1检测OSA患犬血液中OSA细胞的设门策略。（A）对高FSC和高SSC的细胞进行设门。

（B）排除双重。（C）在680和575 无转移的低荧光对单个活细胞设门。（D）对荧光素阴性的单个活细胞设门。（E）对与COL I-FITC抗体同型匹配的单个活细胞进行连续设门。

 

 

图2骨肉瘤患犬中随时间推移的CTC/10 6细胞数量。（A）犬（n = 12）有转移前峰值；（B）犬（n = 9）没有转移前峰值（p = 0.904）。*犬21存活到研究结束（时间点W），但在时间点H后没有返回采集血样。

 

 

图3跨越1184天对有CTC峰值（实线；n = 12）或无CTC峰值（虚线；n = 9）的OSA患犬的Kaplan-Meier生存估算（p =0 .0107）。没有CTC峰值的6只犬被剔除（X轴标记）。

 

 

 

犬	性别	品种	日龄	体重（kg）	ALP  （U/L）a	肿瘤位置	体侧	诊断前疾病（天）
1	雄性去势	拉布拉多犬	2062	40	143	肱骨近端	左	42
2	雄性去势	金毛猎犬×贵宾犬	2372	25	17	桡骨远端	左	48
3	雄性去势	澳洲牧羊犬	3303	23	52	桡骨远端	左	61
4	雌性绝育	拉布拉多犬混血	3516	26	22	桡骨远端	右	67
5	雄性去势	哈士奇混血	2399	29	24	尺骨近端	右	35
6	雌性绝育	大丹犬	2374	53	158	胫骨远端	左	39
7	雌性绝育	大丹犬	2208	50	45	肱骨近端	右	57
8	雄性去势	德国牧羊犬	2632	36	26	桡骨远端	右	19
9	雄性去势	拉布拉多犬	3709	32	195	胫骨近端	右	29
10	雌性绝育	拉布拉多犬	3724	36	120	股骨远端	左	82
11	雄性去势	卡他豪拉豹犬	3918	34	1524	肩胛骨	右	32
12	雌性绝育	大白熊犬	1926	40	29	股骨远端	右	19
13	雄性去势	混血犬	3133	23	41	桡骨远端	左	50
14	雌性绝育	哈士奇牧羊犬×	3754	38	34	桡骨远端	左	21
15	雄性去势	大丹犬	3569	63	129	桡骨远端	右	4
16	雌性绝育	牧羊犬×罗威纳犬	2770	32	108	桡骨远端	右	11
17	雄性去势	牧羊犬×罗威纳犬	2904	42	100	肱骨近端	右	58
18	雄性去势	边境牧羊犬	3308	26	33	桡骨远端	右	58
19	雌性绝育	美国斗牛犬	3277	40	53	胫骨远端	左	30
20	雌性绝育	德国牧羊犬松狮犬×	2637	32	75	胫骨远端	右	27
21	雄性去势	法兰德斯牧牛犬	2291	39	45	胫骨远端	左	34

表1 21只四肢骨肉瘤患犬的临床特征。

a碱性磷酸酶（参考范围22-143 U/L）。

 

犬	肿瘤体积（ cm 3）	组织病理学诊断	转移位点	无病间期（天）	生存时间（天）	剖检发现
1	144.3	成软骨细胞型	肺	53	123	无数据
2	0.131	成纤维细胞型，1级	肺	721	841	转移：腹膜后腔、肾、心、肺
3	35.56	成骨细胞型，2级	肺	300	342	无数据
4	6.28	OSA，3级	无；软组织肉瘤	-	966	无转移
5	无数据	OSA	无，存活	-	1042	无数据
6	23.56	OSA，2级	肋骨，肝	95	106	转移：肋骨和肝脏
7	无数据	OSA	肺	112	374	无数据
8	7.85	成骨细胞型		687	687	转移：肋骨和脊椎
9	280.65	OSA	肺	182	319	无数据
10	1734.16	毛细血管扩张型，3级	肺	265	265	转移：肺、肾
11	109.96	成骨细胞型，3级	肺，腹部	88	88	转移：肺、肾、心、肝
12	31.42	OSA，2级	无；骨科	-	851	十字韧带断裂
13	6.28	成骨细胞型，3级	肺	322	540	转移：肾上腺、肺、心、肾
14	34.56	成骨细胞型，3级	肺	329	383	转移：肺
15	无数据	OSA，1级	无；血管肉瘤	-	266	血管肉瘤：脾、心、肝
16	4.71	OSA，1级	脊椎	589	589	转移：脊椎
17	164.93	成软骨细胞型	肺	92	242	无数据
18	7.85	OSA	无；神经系统疾病	-	534	无数据
19	21.99	成骨细胞型	肺	91	109	无数据
20	144.3	成纤维细胞型，2级	肺	97	147	无数据
21	0.131	OSA	无，存活	-	1058	无数据

表2肿瘤特征和疾病转归。

 

 

犬	样本数量	CTC峰值	CTC峰值数	转移时的CTC数	峰值到转移的天数
1	5	是	487	143	21
2	12	是	2425	732	55
3	7	是	2806	1	35
4	21	否	无转移	无转移	无数据
5	21	否	无转移	无转移	无数据
6	7	是	322	27	57
7	5	是	975	975	1
8	17	否	无峰值	478	无数据
9	5	是	599	599	1
10	7	否	无峰值	ND	无数据
11	4	是	277	ND	40
12	6	否	无转移	无转移	无数据
13	8	是	2110	75	111
14	7	是	1123	340	56
15	8	否	无转移	无转移	无数据
16	12	否	无峰值	无数据	无数据
17	4	是	862	无数据	34
18	10	否	无转移	无转移	无数据
19	6	是	2311	118	27
20	7	是	1080	1080	1
21	6	否	无转移	无转移	无转移

表3随时间变化的循环肿瘤细胞（CTC）。CTC峰值定义为时间点C（首次化疗）后CTC数最大值。转移前峰值定义为转移后100日内CTC的增加。

杨先生

南海

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