【兽医肿瘤前沿】西妥昔单抗在体外对猫口腔鳞状细胞癌基质金属蛋 ...

胡璠

西妥昔单抗在体外对猫口腔鳞状细胞癌基质金属蛋白酶2和9、上皮-间充质转化和细胞迁移的抑制

翻译：徐晋

 

摘要

猫口腔鳞状细胞癌(FOSCC)具有侵袭性和转移性的特点，目前的治疗效果不佳，因此需要新的治疗策略。FOSCC与头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)有共同的分子靶点，其中包括表皮生长因子受体。西妥昔单抗是一种用于治疗HNSCC的抗表皮生长因子受体单克隆抗体，有趣的是，之前的体外研究表明，它对FOSCC也显示出细胞抑制和细胞毒性。在本研究中，我们旨在进一步研究西妥昔单抗对在人类患者中已证实的侵袭和转移通路的影响。西妥昔单抗处理FOSCC细胞株SCCF1、SCCF2和SCCF3 48/72 h, Western blot检测基质金属蛋白酶2/9 (MMP-2/9)和上皮-间充质转化标志物波形蛋白(vimentin)、E-、P-和N-钙黏蛋白的表达。西妥昔单抗处理后，MMP-2/-9在3种细胞株中均呈剂量依赖性下调。此外，西妥昔单抗下调了SCCF1细胞的波形蛋白和P-钙黏蛋白；上调了SCCF2细胞的E-钙黏蛋白、下调了P-/N-钙黏蛋白；下调了SCCF3细胞的P-/N-钙黏蛋白。体外划痕试验也表明西妥昔单抗可延迟SCCF3细胞的迁移。西妥昔单抗通过抑制MMPs和上皮-间充质转化途径减缓FOSCC的侵袭和转移过程，提示该单克隆抗体可能有助于对抗恶性进展和改善局部侵袭性疾病的管理。

 

关键词：猫，细胞迁移，西妥昔单抗，上皮-间充质转化，基质金属蛋白酶，口腔鳞状细胞癌

鳞状细胞癌(SCC)是猫最常见的口腔癌。由于其高度侵袭性(aggressive and invasive)行为，其临床过程以恶性为特征，因而预后通常较差。起源于牙龈的肿瘤易侵袭下颌骨和上颌骨，舌根(最常见部位)的病变易向深部浸润邻近软组织。猫口腔鳞状细胞癌(FOSCC)的转移过程是缓慢的，并且区域淋巴结以外的转移很少有报道。然而，实际的转移率被低估了，因为在转移有临床意义之前，猫已死于与原发肿瘤相关的并发症。FOSCC对放化疗反应差，手术治疗效果不佳。事实上，即使进行了上颌骨切除术和下颌骨切除术等根治性手术，复发也很常见。因此，比较肿瘤学研究正试图评估已建立的人类治疗靶点(其中包括表皮生长因子受体(EGFR))在猫药物中的可转化性。

事实上，与头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)相似，EGFR在FOSCC中过表达。在人类疾病中，EGFR驱动非计划的细胞增殖和生存，从而促进肿瘤转化。然而，有可靠的体外和体内证据表明，EGFR通过诱导导致侵袭和转移的两个关键过程(即基质金属蛋白酶2和9 [MMP-2/-9]的表达以及上皮-间充质转化[EMT])，在恶性进展中也发挥关键作用。

基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, mmp)是一类能够降解细胞外基质(extracellular Matrix, ECM)中多种蛋白的蛋白水解酶，根据底物的特异性分为不同类群。MMP-2和MMP-9属于明胶酶，在多种生理过程(如伤口愈合)中降解和重塑ECM。然而，癌细胞利用MMP-2和MMP-9增加迁移能力并降解基底膜，从而有利于肿瘤细胞向原发病灶周围组织扩散。MMP-2和MMP-9也参与EMT，进一步促进恶性肿瘤的发生。MMP-2和MMP-9在人类黑色素瘤侵袭和转移中的作用已得到广泛证实，它们的表达与疾病进展相关。有趣的是，类似的作用已在各种人类和动物SCC(包括HNSCC)中得到证实。体外研究表明，EGFR，除了其经典的下游通路，也调节MMP-2和MMP-9的表达，因此在HNSCC的侵袭和转移中具有关键作用。

EMT是上皮肿瘤细胞向间质表型转化的生物学过程，随后其外观和行为发生变化。这些变化包括细胞极性和细胞间黏附的丧失、梭形形态的获得和迁移潜能的增强，使癌细胞更容易侵袭和转移。这一表型转化由一系列分子事件驱动，如波形蛋白表达增加和所谓的“钙黏蛋白转换”(由E -钙黏蛋白表达向P-和N -钙黏蛋白表达转变的过程)，这一过程损害了细胞间的黏附，促进了细胞的运动。有可靠的证据表明，在体内和体外，EGFR调节这些分子途径，并诱导HNSCC发生EMT，因此在HNSCC的转移过程中发挥关键作用。

西妥昔单抗是一种抗EGFR单克隆抗体(mAb)，已被批准用于治疗HNSCC。基于这些理由，我们努力评估了该mAb治疗猫HNSCC的潜力。最近，研究表明西妥昔单抗可干扰EGFR通路，并在三个经过验证的FOSCC细胞系中显示出细胞抑制和细胞毒性作用，即SCCF1(喉鳞癌)，SCCF2(牙龈鳞癌)和SCCF3(舌鳞癌)。

在本研究中，我们旨在研究西妥昔单抗在体外模型中抑制MMPs表达和EMT的能力，并通过这种能力来抑制FOSCC的侵袭和转移。

为此目的，将SCCF1, SCCF2和SCCF3用两种不同浓度的西妥昔单抗处理，即50和100 μg/mL，或不处理(对照组)。分别于48 h和72 h后收集细胞进行Western blot检测。通过密度分析测定MMP-2和MMP-9的表达水平。处理、WB和密度测定方法参见其他文章。与之前的研究结果一致，在未处理的SCCF1、SCCF2和SCCF3中观察到MMP-2和MMP-9的内源性表达。相比之下，西妥昔单抗处理导致三个细胞系中两种明胶酶的下调，且呈剂量依赖性(图1A-C)。在SCCF1和SCCF2中，我们在72 h后观察到这一效应(图1A,B)。SCCF3对西妥昔单抗治疗更敏感，MMP-2/-9在48小时后已经下调(图1C)。这些发现可以在几个独立的试验中重现(未显示)。这与体外在人HNSCC细胞和小鼠模型中获得的数据一致，这些数据表明西妥昔单抗可抑制EGFR驱动的MMPs表达。本研究结果提示该药物可能抑制FOSCC细胞的迁移、侵袭和转移。

WB分析还用于确定西妥昔单抗处理的细胞和未处理的细胞中EMT标志物的表达。检测的蛋白包括上皮标志物E-cadherin和间质标志物P-cadherin、N-cadherin和vimentin。与之前的研究结果一致，即使在P-cadherin存在的情况下，所有未经处理的细胞系仍保持E-cadherin的表达(图S1)。这一观察结果并不令人惊讶。EMT分子机制具有高度可塑性，表型从上皮细胞转变为间充质细胞，反之亦然。在这种情况下，完全EMT很少实现。在人类HNSCC中，大多数肿瘤细胞显示部分EMT (pEMT)表型，其特征是上皮和间质蛋白的共表达。重要的是，上皮标志物的部分保留被认为与维持对西妥昔单抗的敏感性具有功能相关性。事实上，完全EMT与荷瘤患者的体外反应差和EGFR抑制剂耐药相关。这可能有助于解释SCCF1-3对西妥昔单抗的敏感性。在所有细胞系中均观察到波形蛋白和N -钙黏蛋白的表达(图S1)，证实细胞正向EMT转移。然而，这一结果与文献的部分不一致，波形蛋白未在SCCF2中发现，N-cadherin仅在SCCF3中检测到。我们假设这种差异可能是由于使用了不同的技术(即WB vs.免疫组织化学)。

在评估西妥昔单抗对EMT蛋白表达的影响时，我们发现，与未处理的对照细胞相比，西妥昔单抗处理72小时诱导了SCCF1中波形蛋白的剂量依赖性减少(图2A)。然而，这种降低并不影响E -钙黏蛋白或N-钙黏蛋白的表达(数据未显示)。对人口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞系的研究表明，西妥昔单抗诱导的这种分子反应虽然不完全，但可能减弱EMT。此外，西妥昔单抗在72小时后以剂量依赖性的方式降低P-钙黏蛋白，提示其对抑制SCCF1的EMT有辅助作用。

在SCCF2细胞中，处理48 h引起E-钙黏蛋白浓度依赖性增加，72 h后N- cadherin和P-cadherin水平降低(图2B)。以前的报道描述了西妥昔单抗处理的人口腔鳞状细胞癌细胞系的这种间质-上皮转化(MET)。根据我们的数据，我们认为西妥昔单抗对SCCF2有类似的作用。

在SCCF3细胞中，P-钙黏蛋白的表达在处理后48小时内下降，而N-钙黏蛋白的下调需要72小时，mAb剂量越高越有效(图2C)。然而，与SCCF1一样，未观察到E-钙黏蛋白的增加(未显示)。有证据表明，在人头颈鳞癌中，西妥昔单抗上调E-钙黏蛋白可能不是逆转EMT所必需的。因此，我们假设这也适用于SCCF3和SCCF1。最近关于人OSCC细胞的研究表明，这一概念可能会根据细胞系扩展到其他EMT标记。这与在SCCF2和SCCF3治疗后观察到的波形蛋白表达维持一致(数据未显示)。

西妥昔单抗可影响P-钙黏蛋白的表达。该分子是在HNSCC原发肿瘤和转移灶中发现的主要EMT相关膜蛋白，其表达与不良预后相关。有趣的是，以前的报告指出FOSCC中有类似的作用。因此，西妥昔单抗下调所有三个SCCF细胞系中P-钙黏蛋白的表达可能与该抗体的治疗应用尤其相关。

综上所述，我们的结果表明，西妥昔单抗治疗FOSCC后，EMT通路的变化是分子异质性的，这取决于肿瘤细胞的生物学背景，在人类OSCC中也观察到类似的变化。此外，最近的一项研究表明，在人类OSCC中，独立于EGFR的其他分子可能调节FOSCC中的EMT，这进一步解释了我们在猫细胞模型中获得的不均匀反应。

在西妥昔单抗诱导的MMP-2和MMP-9表达下降和EMT发生后，我们通过体外划痕试验验证SCCF1, SCCF2和SCCF3细胞是否对应于迁移能力的降低。100μg/mL西妥昔单抗处理细胞8、24和48 h后，拍摄48张图片和获得测量结果。结果显示，西妥昔单抗在SCCF3中处理24小时后减慢了细胞迁移(图3A,B)，但在SCCF1和SCCF2中没有。这一发现与早期在SCCF3中观察到的生化应答一致，证实了SCCF3对治疗的敏感性较高。将SCCF1和SCCF2的试验时间延长至48 h，以检测与SCCF3相比的延迟效应。然而，在处理过的SCCF1中没有观察到对细胞迁移的影响，而在未处理和处理过的SCCF2中，伤口边缘融合(数据未显示)。

同样，这种明显的不一致可能是基于生物学基础，例如在SCCF1和SCCF2中出现了不依赖EGFR的促迁移途径和/或延迟的生化反应，这可能是划痕试验无法测量的生物学效应的预兆。在之前的研究中，使用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)吉非替尼处理的SCCF1细胞的划痕试验显示细胞迁移受损，这可能是因为靶向EGFR的TKI在体外表现出比西妥昔单抗更高的活性。然而，西妥昔单抗填补了这一空白，更重要的是，SCCF1对吉非替尼产生了耐药。因此，在未来的猫的治疗中，单克隆抗体可能优于TKI。

总之，我们的数据表明，西妥昔单抗可能至少部分地削弱肿瘤细胞的侵袭和转移潜能，为其在FOSCC治疗中的潜力提供了进一步的证据，特别是通过阻止恶性进展和可能有助于局部侵袭性疾病的管理。我们的研究再次确认，单抗疗法可以而且应该在宠物中被引入，推动了一个新的时代，在这个时代，这些对抗人类癌症的武库中的“神奇的子弹”，也成为兽医肿瘤学的巩固现实。

 

 

图1西妥昔单抗下调猫口腔鳞状细胞癌细胞系中的基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9(A-C)。SCCF1、SCCF2和SCCF3细胞经50、100 μg/mL西妥昔单抗作用48、72 h后，采用Western blot法检测MMP-2/-9的表达。代表性的WB实验显示SCCF1 (A)， SCCF2 (B)和SCCF3 (C)中西妥昔单抗处理的细胞比未处理的对照细胞(CTRL)中MMP-2/-9的表达降低。在(A)中，以相同曝光时间从相同凝胶中切取盒并根据装载于凝胶上的分子标准适当排列。将印迹剥离并重新检测β-肌动蛋白，以确保可比较的蛋白载量并允许标准化。来自至少两个重复的独立试验的标准化的β-肌动蛋白表达±SD的平均密度测定值显示在每个面板的右侧。计算SCCF1, SCCF2和SCCF3在西妥昔单抗处理后的MMPs蛋白水平的变化。

 

 

图2西妥昔单抗调节猫口腔鳞状细胞癌细胞系中的上皮-间质转化标志物(A-C)。SCCF1、SCCF2和SCCF3经50、100 μg/mL西妥昔单抗作用48、72 h后，采用Western blot法检测SCCF1、SCCF2和SCCF3细胞波形蛋白(vimentin)、E-、P-和N-钙黏蛋白的表达。WB试验显示，与对照条件(CTRL)相比，处理SCCF1的波形蛋白和P-钙黏蛋白(A)下调，处理SCCF2的E-钙黏蛋白(B)上调，P-/N -钙黏蛋白下调，处理SCCF3的P-/N -钙黏蛋白(C)下调。将印迹剥离并重新检测β-肌动蛋白，以确保可比较的蛋白载量并允许标准化。来自至少两个重复的独立试验的标准化的β-肌动蛋白表达±SD的平均密度测定值显示在每个面板的右侧。计算SCCF1, SCCF2和SCCF3在西妥昔单抗处理后的蛋白水平变化。

 

 

 

图3西妥昔单抗减缓猫口腔鳞状细胞癌细胞系SCCF3中的细胞迁移。(A)体外划痕试验检测100 μg/mL西妥昔单抗对SCCF3细胞的作用：在0、8和24小时拍摄的代表性图片显示，西妥昔单抗处理的细胞比CTRL处理的细胞迁移延迟。(B)处理细胞(100 μg/mL)和未处理细胞(CTRL) 8、24 h后相对迁移的图形表示为空白宽度相对于0小时（设为100%）减少的百分比。数据显示为来自每种试验条件的至少五个视野的至少三次测量的平均值±SD并且代表产生可比趋势的两个独立试验。

杨先生

南海

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